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[求救] 請教IP-Mass後的Co-IP驗證

看板Biotech (生命科學)作者 (RAYPTT)時間6年前 (2018/07/06 11:29), 6年前編輯推噓14(14推 0噓 31→)
留言45則, 5人參與, 6年前最新討論串1/1
大家好 這裡有一些與Co-IP、protein-protein interaction的問題想請教 我們以IP-Mass Screen出一些欲研究蛋白"X" 之interacting protein candidates後 (Y1.Y2.Y3...) 再使用Co-IP重複驗證X與Y們的interaction 發現如果IP下X的immunoprecipitates 能夠以Western blot偵測到 X Y1 Y2 Y3等的存在 但是反過來分別IP Y1 Y2 或Y3時 卻都只能偵測到他們自身的存在 而無法偵測到X (使用IP用Ab或另一隻anti-X Ab都無法偵測到) 請問這樣的情況應該如何解釋？ 或是說單向IP的證據就已足夠？ 第一個想法是量的差異 如果X可以結合10個蛋白其中一個是Y1 而Y1可以結合1000個蛋白其中一個是X 那自然抓下X容易偵測到Y1 可是反之卻不然 第二個想法是Ab-Ag在IP過程中conformation改變 進而影響結合蛋白情況 但這相當難以實驗證實 最後 我也有猜測X的Ab專一性太低 抓到許多非X的雜蛋白 所以才偵測到false positive 但若是這種情況 IP下 Y1 Y2 Y3 仍然應該可以用anti-X去偵測到才對(?) PS1 我們IP的target都是endogeneous protein，細胞均未處理/未overexpress PS2 IP-Mass的結果是重覆兩次相同實驗後取交集而來 PS3 IP過程均有做Posi/Negative control (Whole lysate, beads only, IgG isotype) PS4 IP與WB都是用同一隻抗體 有任何資訊不足的再請提出 非常謝謝大家 -- ※ 發信站: 批踢踢實業坊(ptt.cc), 來自: 140.112.121.122 ※ 文章網址: https://www.ptt.cc/bbs/Biotech/M.1530847751.A.A04.html ※ 編輯: ararthur (140.112.121.122), 07/06/2018 11:56:00
推
07/06 11:47, 6年前 , 1F
IP a抓到 b ,不代表反過來做就會成功，必須考慮IP用抗
07/06 11:47, 1F
→
07/06 11:47, 6年前 , 2F
體的epitope; 尤其你又是 endogenous protein
07/06 11:47, 2F
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07/06 11:48, 6年前 , 3F
可能你b抗體認的位置就是 他跟 a interact的位置,那你
07/06 11:48, 3F
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07/06 11:48, 6年前 , 4F
怎麼抓也都只有 freeform的 b而已
07/06 11:48, 4F
推
07/06 11:56, 6年前 , 5F
可能染個 IF或 用293t o/e 接 tag的蛋白去證明吧，真
07/06 11:56, 5F
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07/06 11:56, 6年前 , 6F
的要的話
07/06 11:56, 6F
謝謝 請問染IF是看 co-localization嗎? ※ 編輯: ararthur (140.112.121.122), 07/06/2018 11:59:34
推
07/06 12:14, 6年前 , 7F
嗯嗯沒錯，我那時是做到單向 IP跟染色; 想做更細一點
07/06 12:14, 7F
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07/06 12:14, 6年前 , 8F
也能做 GST pulldown assay，但這也未必會成功就是了
07/06 12:14, 8F
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07/06 12:14, 6年前 , 9F
。
07/06 12:14, 9F
推
07/06 16:22, 6年前 , 10F
還有可能是Y1,Y2是beads或resin contaminants 並不是
07/06 16:22, 10F
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07/06 16:22, 6年前 , 11F
真的interaction...
07/06 16:22, 11F
推
07/06 16:28, 6年前 , 12F
sorry 沒看到你的PS3 不過正常Co-IP 驗證會OE 所以第
07/06 16:28, 12F
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07/06 16:28, 6年前 , 13F
一點不太會發生
07/06 16:28, 13F
推
07/06 16:35, 6年前 , 14F
另外T大講的事件容易發生在小的蛋白上 除了改pulldown
07/06 16:35, 14F
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07/06 16:35, 6年前 , 15F
嘗試外 也可試試純化（小tag或不帶tag)crosslink 後跑
07/06 16:35, 15F
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07/06 16:35, 6年前 , 16F
PAGE 或跑SEC看有沒有peak shift (之前做～15Da IP或
07/06 16:35, 16F
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07/06 16:35, 6年前 , 17F
pulldown 常發生 blocking 的現象）
07/06 16:35, 17F
謝謝J大回覆 可是我的X蛋白~80KDa Y蛋白們則在40-90kDa 其中X蛋白用的IP 抗體是polyclonal Y蛋白大部分是monoclonal(Brand=CST) 說到Size exclusion chromatography 我之前試圖做過lysate直接跑SEC (Akta) fractions拿去測X蛋白的位置 發現X大約出現在相對MWCO>=440KDa的時間點 所以才非常想知道那麼大的complex裡面藏了什麼
推
07/06 16:41, 6年前 , 18F
J大： 沒錯我兩個蛋白剛好15跟25kDa,做起來超崩潰qq
07/06 16:41, 18F
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07/06 16:41, 6年前 , 19F
還會卡 light chain
07/06 16:41, 19F
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07/06 19:11, 6年前 , 20F
我覺得會拿來做IP-mass,就至少對抓的效率(%,對比input)有
07/06 19:11, 20F
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07/06 19:12, 6年前 , 21F
信心,只是Y1,Y2抓的效率差,就只剩IP自己,看不到coIP蛋白了
07/06 19:12, 21F
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07/06 19:13, 6年前 , 22F
而且我自己經驗WB最強跟IP最佳常不相同,如果一定試到底,
07/06 19:13, 22F
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07/06 19:13, 6年前 , 23F
Y系統抗體有需要找IP能抓更多的來試
07/06 19:13, 23F
報告B大 其實我覺得我們的實驗中 對於input lysate amount來說 X蛋白的IP抓下來的比例並不是很高耶...(慚愧) 送去做Mass 純粹是我們真的太想知道X的interacting protein有哪些的粗暴方式 不過做了兩次IP-Mass 重複出現的比例還蠻高的(有扣除Negative ctrl的 noise) 雖然我知道WB會放大訊號 得到的訊號也只是相對值 但是IP 幾個Y蛋白後 WB偵測到他們自己的量還蠻高的 甚至有一個還燒band(過量)了 (~100ug lysate as input) 抓到的效率% 要等我到Lab時看看 我會再考慮其他可用的抗體 或是測看看其他interacting protein candidates 另外有個延伸IP-Mass的問題想詢問 IP-mass抓下來的蛋白 我們挖了兩條相對於negative ctrl多出來的band去打mass 扣除掉相對位置的IgG isotype control的結果後 還出現數百個蛋白 是常見的事嗎？ 因為實不相瞞 即使從兩次independent IP-mass抓下來交集的蛋白種類都超過150種了... 有點覺得太多XDDD
推
07/06 23:21, 6年前 , 24F
yeast 2 hybrid?
07/06 23:21, 24F
推
07/06 23:24, 6年前 , 25F
驗證也是MS嗎?
07/06 23:24, 25F
I大您好 之前也有考慮過Y2H 不過曾聽過作Y2H的實驗室透露Y2H和IP-Mass screen interacting protein時 常會出現蠻不一致的結果 但Y2H的確和IP的機制不太一樣 結果就沒有嘗試了 就您的經驗 用Y2H去驗證protein interaction有效率嗎？ 謝謝各位的回覆^^ ※ 編輯: ararthur (36.230.227.43), 07/07/2018 01:12:48
推
07/07 23:08, 6年前 , 26F
y2h 幾乎是要重新建立一個新系統欸
07/07 23:08, 26F
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07/07 23:16, 6年前 , 27F
看你究竟對 Y123是怎樣的研究興趣耶;如果是抓可能的 i
07/07 23:16, 27F
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07/07 23:16, 6年前 , 28F
ntx protein來研究 X的功能, 補個 tag o/e IP 的實驗
07/07 23:16, 28F
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07/07 23:16, 6年前 , 29F
比較快也較接近實際狀況 (可還能看 Y123是否跟 X形成
07/07 23:16, 29F
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07/07 23:16, 6年前 , 30F
complex)
07/07 23:16, 30F
推
07/08 14:52, 6年前 , 31F
1D PAGE一條band打到上百還算正常
07/08 14:52, 31F
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07/08 14:52, 6年前 , 32F
另外IP用 polyclonal 很容易抓到False positive 建議
07/08 14:52, 32F
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07/08 14:52, 6年前 , 33F
在ID時拉高criteria 話說妳如果要問complex 為何不直
07/08 14:52, 33F
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07/08 14:52, 6年前 , 34F
接 purify complex直接打MS 配合IP這樣不是比較直觀嗎
07/08 14:52, 34F
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07/08 14:52, 6年前 , 35F
XD
07/08 14:52, 35F
推
07/08 14:54, 6年前 , 36F
可以直接crosslink->purify complex(SEC/IP)接MS
07/08 14:54, 36F
推
07/08 15:06, 6年前 , 37F
我覺得做pulldow跟帶tag的co-IP比較好
07/08 15:06, 37F
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07/08 15:07, 6年前 , 38F
endogenous association可以交給IF來判定
07/08 15:07, 38F
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07/08 15:07, 6年前 , 39F
如果覺得IF不夠好,也可以試試看FRET
07/08 15:07, 39F
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07/08 15:08, 6年前 , 40F
不過我們是習慣把結合位去除再來看位置判斷居多
07/08 15:08, 40F
推
07/08 15:10, 6年前 , 41F
帶tag的實驗也可以驗證抗體會不會block你的訊號
07/08 15:10, 41F
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07/09 16:06, 6年前 , 42F
忽然想到 也許y3是secondary binding 假設是y1 y2的co
07/09 16:06, 42F
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07/09 16:06, 6年前 , 43F
mplex才抓得到y3?
07/09 16:06, 43F
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07/09 16:07, 6年前 , 44F
我是覺得你control有做好 單向就可以發了啦 甚至可以
07/09 16:07, 44F
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07/09 16:07, 6年前 , 45F
把反向抓不到也寫進results
07/09 16:07, 45F
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