[求救] 透析後的純化蛋白BCA定量問題

看板Biotech (生命科學)作者 (RAYPTT)時間7年前發表 (2018/07/19 04:39), 6年前編輯推噓4(405)
留言9則, 4人參與, 6年前最新討論串1/1
有關蛋白純化/透析/蛋白定量的問題想請教, 我自行純化的純化蛋白X 在透析前以BCA定量, 測定出來的濃度在 56.5 ug/ml; 以Thermo SnackSkin透析膜(10k MWCO) Dialysis後再以BCA定量, 測定出來的濃度卻高達 1100 ug/ml, 請教有什麼可能能夠解釋出現這種狀況嗎? 非常感謝! PS1 原Sample buf condition = 25mM Tris-HCL, 100mM Glycine pH未知 PS2 蛋白純化過程的buf如下 Elution buf= 1ml of 100mM Glycine (pH 3.5) Nutralization buf= 25ul of 1M Tris (pH 8.0) PS3 Dialysis buf condition = 25mM Tris-HCL, 100mM Glycine (pH 7.3) PS4 由於buf condition是相同的,透析前後體積未劇烈變化 PS5 透析前後BCA呈色狀況不同(前:淡藍綠色 vs. 後:類似stanard的紫色), 如圖所示 https://imgur.com/YVeFpiy
PS6 兩次BCA的 R^2 均>0.996 -- ※ 發信站: 批踢踢實業坊(ptt.cc), 來自: 140.112.121.122 ※ 文章網址: https://www.ptt.cc/bbs/Biotech/M.1531975146.A.1B1.html

07/19 17:23, 7年前 , 1F
看起來很像透析前的buffer影響的喔
07/19 17:23, 1F

07/19 17:35, 7年前 , 2F
有可能影響BCA定量的干擾物被你用透析去掉了。也可以確
07/19 17:35, 2F

07/19 17:35, 7年前 , 3F
認一下BCA定量的compatible table看看使用的buffer會不
07/19 17:35, 3F

07/19 17:35, 7年前 , 4F
會影響。
07/19 17:35, 4F
謝謝,另外我有測Sample與Dialysis buf的pH值,都是相近的中性(用試紙測試), 重做一次BCA,也是一樣的結果, 我來找看看BCA定量的資料,是否Buffer或其他干擾物有可能造成此現象。

07/19 19:03, 7年前 , 5F
你透析幾次?每次體積多少?
07/19 19:03, 5F
您好,透析兩次各兩小時,Sample體積2.5ml,Buffer體積500ml。

07/19 21:47, 7年前 , 6F
蛋白質樣品用透析方法很容易染菌
07/19 21:47, 6F

07/19 22:47, 7年前 , 7F
另外protein assay 會被四級胺影響,例如0.1M的Glycine或
07/19 22:47, 7F

07/19 22:47, 7年前 , 8F
CTAB等等。
07/19 22:47, 8F
您好,透析過程我都將燒杯至於冰中,理論上應該是不會菌的汙染才是 謝謝,但我是推估前後sample的buf是一樣的,所以還在想到底哪一項沒估算到@@

07/19 23:28, 6年前 , 9F
會不會純化前有還原劑,SDS或金屬螯合劑?
07/19 23:28, 9F
謝謝回覆,有猜測,但理論上在純化過程時應該已經被沖洗掉了, 我會試著用不同的蛋白定量方試看看, 會先試看看Bradford assay,再上來跟大家報告,謝謝大家的回覆。 ※ 編輯: ararthur (140.112.121.122), 07/20/2018 10:44:58 今天用Bradford assay 測定Dialysis前後的蛋白濃度, 令人訝異所測到的濃度相仿,看來BCA assay並不適合我的重組蛋白... 另外以Coomassie Blue R250染出來的band 透析前後也是差不多, Coomassie Blue system (包含Bradford)似乎比較合適。 謝謝各位參與討論 <(_ _)> ※ 編輯: ararthur (140.112.121.122), 07/20/2018 14:39:46 補充一下,後來我使用BCA protein assay 將reagent B提高3x (Cu2+濃度提高) 便可以讓dialyzed protein呈現與undialyzed protein相仿的濃度了! 看來是dialysis影響了Cu2+的還原了...但原因仍未解 提供一些經驗供大家參考 再次謝謝 ※ 編輯: ararthur (36.229.11.1), 08/13/2018 00:52:43
文章代碼(AID): #1RK1Ng6n (Biotech)
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