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[求救] RNA去除gDNA的方法

看板Biotech (生命科學)作者 (雅)時間6年前 (2018/08/16 11:59), 6年前編輯推噓4(4推 0噓 23→)
留言27則, 8人參與, 6年前最新討論串1/1
大家好，最近在抽乳酸菌的RNA，但總是會有gDNA的汙染， 因為後續要做QPCR，原核生物也無法用引子避開DNA的汙染的問題。 我是用Qiagen的抽RNA kit，也買了DNase做on-column或者elution之後gDNA的去除， 但總是去不乾淨.....>"< 都改成37度反應30min了還不行(kit是建議20-30度10-15min)， 跑電泳是看不到gDNA那條band，但我將RNA直接PCR 16S基因就是有band，還頗亮..... 已經不知道要改什麼了.... 另外，kit是說建議菌量<1e+9 cfu， 可是我使用這個菌量下去萃RNA濃度就是很低阿，10-20ng/ul(最後只elute 30ul) 所以只能提高菌量，有人一樣用這個kit萃這種菌數可以得到很高濃度的RNA嗎?? 當然因為實驗的關係我是抽stationary phase的RNA，不過有可能低成這樣嗎?? 另外培養基很複雜，不是那種MRS養的.. 破菌是採用bead的方法，還是用lysozyme會比較好?? 請問有沒有人抽G(+)細菌RNA然後沒有gDNA的污染的， 是用什麼方法抽的??如果是用kit的最好，感謝大家!!! -- ※ 發信站: 批踢踢實業坊(ptt.cc), 來自: 118.163.159.117 ※ 文章網址: https://www.ptt.cc/bbs/Biotech/M.1534391976.A.C12.html ※ 編輯: yaliu (118.163.159.117), 08/16/2018 12:02:07
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08/16 19:39, 6年前 , 1F
我之前也用Qiagen家的RNA kit抽真菌,確實On-column的除
08/16 19:39, 1F
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08/16 19:39, 6年前 , 2F
不乾淨
08/16 19:39, 2F
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08/16 19:44, 6年前 , 3F
好奇的是妳看不到gDNA的band,那16s 23s 5s都清楚嗎
08/16 19:44, 3F
16s 23s看的到，5s很淡幾乎沒有 不過直接PCR 16S還是很亮， 上qPCR CT值還是20幾... 所以跑膠看有沒有gDNA汙染看起來也不太可信， 還是PCR最準!!
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08/16 19:45, 6年前 , 4F
如果kit不行是建議換Trizol,用分層的污染會少很多,過col
08/16 19:45, 4F
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08/16 19:45, 6年前 , 5F
umn多少都會殘留
08/16 19:45, 5F
想說trizol是最後一步
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08/16 22:04, 6年前 , 6F
用Trizol抽回收量應該有機會column高吧
08/16 22:04, 6F
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08/16 22:04, 6年前 , 7F
我們實驗室有時候DNase會吃兩趟，給您參考
08/16 22:04, 7F
沒錯，我最後也是吃兩次才"比較乾淨"， PCR很弱band, qPCR看不到(有稀釋成假設轉cDNA要上機的濃度)， 不過我是做兩次的on-column, 等於就會再浪費一個column了， 想要試試可不可以反應第一次後離掉， 直接再加DNase反應第二次... (都做兩次了PCR還有弱band是怎樣...)
推
08/16 22:51, 6年前 , 8F
trizol 最乾淨, 抽完再用DNase, DNase 用的次數也不要太多
08/16 22:51, 8F
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08/16 22:51, 6年前 , 9F
用多了還是會影響RNA quality
08/16 22:51, 9F
推
08/17 01:20, 6年前 , 10F
turbo dnase, $$$, 但是比較強
08/17 01:20, 10F
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08/17 01:21, 6年前 , 11F
trizol比較高應該是總量超過column的capacity是才明
08/17 01:21, 11F
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08/17 01:21, 6年前 , 12F
顯吧
08/17 01:21, 12F
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08/17 11:51, 6年前 , 13F
我們LAB有些人是Trizol分層後再用column
08/17 11:51, 13F
業務有提供另一款RNAeasy plus的， 也是類似trizol分層，但是是期貨， 想說如果真的要花掉兩個column就要改買這一組了... ※ 編輯: yaliu (223.138.123.221), 08/17/2018 18:30:03
推
08/18 12:15, 6年前 , 14F
trizol 產糧比較高 要clean再過column
08/18 12:15, 14F
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08/18 12:16, 6年前 , 15F
另外不可以多樣品混合嗎？
08/18 12:16, 15F
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08/19 16:52, 6年前 , 16F
弱弱問一下 16sRNA本來就超濃 然後PCR看的到
08/19 16:52, 16F
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08/19 16:52, 6年前 , 17F
表示仍有gDNA污染 是一定的嗎?
08/19 16:52, 17F
推
08/20 08:54, 6年前 , 18F
回樓上,你要一個做對照組,如果超濃你下去當template的量
08/20 08:54, 18F
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08/20 08:54, 6年前 , 19F
也許就會看得到band,然後理論上用oligo dT primer做成cD
08/20 08:54, 19F
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08/20 08:54, 6年前 , 20F
NA是p不到rRNA的,但是RNA quality很好的時候我個人經驗
08/20 08:54, 20F
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08/20 08:54, 6年前 , 21F
還是會p到rRNA,如果是真核生物比較好解決找一對含intron
08/20 08:54, 21F
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08/20 08:54, 6年前 , 22F
基因的primer 去P,如果有DNA污染就會看到含intron的那
08/20 08:54, 22F
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08/20 08:54, 6年前 , 23F
條band,但是樓主是細菌,最好找一段確定不會表現的基因
08/20 08:54, 23F
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08/20 08:54, 6年前 , 24F
來check
08/20 08:54, 24F
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08/20 12:11, 6年前 , 25F
Trizol應該可以提高回收量，但我抽的樣本trizol抽不動XD
08/20 12:11, 25F
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08/20 12:12, 6年前 , 26F
turbo dnase好用，我們要吃兩趟的樣本用Turbo都是一趟就好
08/20 12:12, 26F
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08/31 00:55, 6年前 , 27F
試試加 DpnI 處理。
08/31 00:55, 27F
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