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[求救] PCR的升降溫速度

看板Biotech (生命科學)作者 (大俠讓三招)時間6年前 (2018/12/07 11:53), 編輯推噓7(7推 0噓 34→)
留言41則, 9人參與, 6年前最新討論串1/1
請教各位熟悉PCR機器的高手 正常的PCR機器應該要在幾秒內的誤差到達指定溫度? 我有使用外接的PROBE偵測well內的實際溫度 我的program是 94c 30s 57c 30s 66c 45s 實際測量發現從94到57的時候， probe的溫度剛降到61度時，機器已經開始讀秒， 而當probe顯示真正降到57度時，時間已過了15秒以上了， 其他的step也是這樣，大概都要過10-15秒才能真正到達指定的溫度 請問這樣是正常的嗎 因為我做的是multiplex PCR，最近發現很容易出現non-specific band 會是因為機器溫度sensor壞了之類的關係嗎 麻煩高手幫忙解惑了 感謝 -- ※ 發信站: 批踢踢實業坊(ptt.cc), 來自: 60.250.101.162 ※ 文章網址: https://www.ptt.cc/bbs/Biotech/M.1544154797.A.B67.html
推
12/07 12:34, 6年前 , 1F
我猜應該是機器的特性，防止加熱或降溫過頭，所以接近溫度
12/07 12:34, 1F
→
12/07 12:34, 6年前 , 2F
時會降低速度後逼近設定溫度，至於為何先讀秒就要請廠商問
12/07 12:34, 2F
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12/07 12:34, 6年前 , 3F
問原廠，是說是哪個廠牌的呢？
12/07 12:34, 3F
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12/07 13:12, 6年前 , 4F
Cole-Parmer
12/07 13:12, 4F
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12/07 14:09, 6年前 , 5F
什麼是"幾秒內的誤差到達指定溫度",是指94到57度的時間?
12/07 14:09, 5F
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12/07 14:11, 6年前 , 6F
你是發現機器已經顯示到57度開始數秒,可是實際溫度才61度?
12/07 14:11, 6F
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12/07 14:13, 6年前 , 7F
你是認為probe跟機器同時顯示57度時只剩15秒,所以不OK嗎?
12/07 14:13, 7F
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12/07 16:38, 6年前 , 8F
對,實際才61就開始數秒,這樣我指定30秒不就沒有意義了
12/07 16:38, 8F
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12/07 16:39, 6年前 , 9F
真正作用在57度的時間只有15秒而已
12/07 16:39, 9F
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12/07 16:39, 6年前 , 10F
因為沒測過其他牌子也不知道這種情況是不是正常的
12/07 16:39, 10F
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12/07 17:22, 6年前 , 11F
先不考慮機器有無問題，純看你的擔憂是多慮了
12/07 17:22, 11F
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12/07 17:22, 6年前 , 12F
anneal在高溫不會亂黏，低溫才容易有non-specific band
12/07 17:22, 12F
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12/07 17:23, 6年前 , 13F
而且就算你認為61->57度不該讀秒,primer就不會偷跑嗎？
12/07 17:23, 13F
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12/07 17:23, 6年前 , 14F
還是擔心的話，把anneal設成45秒就不怕時間不夠了
12/07 17:23, 14F
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12/07 17:27, 6年前 , 15F
如果是溫度顯示不準確或定溫後會明顯跳動,問題才大
12/07 17:27, 15F
推
12/07 17:35, 6年前 , 16F
很多機器可以設ramp 不過會真的去測的你是我聽過的第
12/07 17:35, 16F
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12/07 17:35, 6年前 , 17F
一個 推一個
12/07 17:35, 17F
推
12/07 17:39, 6年前 , 18F
pcr大概都是peltier element 測溫跟加熱算是一起的
12/07 17:39, 18F
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12/07 17:39, 6年前 , 19F
所以應該沒壞 大概是設計就是這樣 那你也只能在這台
12/07 17:39, 19F
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12/07 17:39, 6年前 , 20F
機器的特性下去修改你的條件(buffer, program,etc)
12/07 17:39, 20F
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12/07 17:39, 6年前 , 21F
所以寫paper才要寫明機器的牌子XD
12/07 17:39, 21F
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12/07 18:29, 6年前 , 22F
很重要的一點，PCR 機器沒辦法直接去測sample的溫度，
12/07 18:29, 22F
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12/07 18:30, 6年前 , 23F
只能用加熱板上的seneor取得加熱板的溫度，而加熱板的
12/07 18:30, 23F
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12/07 18:31, 6年前 , 24F
的溫度並不代表sample的溫度，所以大部份機器跑PCR時才
12/07 18:31, 24F
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12/07 18:32, 6年前 , 25F
會要你設定反應體積，這是用來讓機器「估計」加熱板達
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12/07 18:33, 6年前 , 26F
到指定溫度時sample理論上要多久才會跟著達到這個溫度
12/07 18:33, 26F
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12/07 18:33, 6年前 , 27F
，直接用probe測會不準很正常，PCR溫度校正也都是校正
12/07 18:33, 27F
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12/07 18:34, 6年前 , 28F
加熱板的seneor，所以是指定一個溫度後看probe最後的終
12/07 18:34, 28F
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12/07 18:35, 6年前 , 29F
點溫度是否和設定一致，而不會去檢測加熱達到指定溫度
12/07 18:35, 29F
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12/07 18:35, 6年前 , 30F
時probe的溫度是否正確。
12/07 18:35, 30F
推
12/07 21:13, 6年前 , 31F
你拿三個水浴鍋作看看
12/07 21:13, 31F
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12/08 05:53, 6年前 , 32F
就算拿三個鍋做實驗，還是會有samples升降溫時間問題 XDD
12/08 05:53, 32F
推
12/08 05:55, 6年前 , 33F
另推原PO的觀察實測精神。
12/08 05:55, 33F
推
12/08 11:23, 6年前 , 34F
你的probe有校正過嗎
12/08 11:23, 34F
推
12/08 14:54, 6年前 , 35F
推樓上BIX大的解釋,也對原PO實測溫度表達敬意
12/08 14:54, 35F
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12/10 11:04, 6年前 , 36F
probe有校驗過喔,另外,我後來找了一台ABI9700來測,
12/10 11:04, 36F
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12/10 11:05, 6年前 , 37F
他的升降溫會稍微超過1-2度,然後再拉回來
12/10 11:05, 37F
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12/10 11:06, 6年前 , 38F
倒數計時也是差不多到指定溫度才開始計時,不會差超過2度
12/10 11:06, 38F
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12/10 11:12, 6年前 , 39F
可能真的是機台設計不同,這樣在使用IVD產品的時候,
12/10 11:12, 39F
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12/10 11:13, 6年前 , 40F
更改pragram內容對於實驗室認證會有困擾><
12/10 11:13, 40F
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12/10 11:14, 6年前 , 41F
感謝各位的解釋&建議
12/10 11:14, 41F
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