[求救] Matrigel seeding細胞後隔天看到網狀結構?

看板Biotech (生命科學)作者steve42125 (Shiburin)時間6年前 (2018/12/22 14:18)推噓7(7推 0噓 5→)

留言12則, 4人參與討論串1/1

先謝謝大家上次關於Transwell migration fix給予的建議，終於成功了。於是接下來用Transwell coating matrigel進行invasion實驗，重複了兩次都以失敗告吹，發現用棉花去除上層染色後，整個Well竟然跟全新的一樣XD 這次在染色前先拿到顯微鏡下看看到底有沒有細胞爬過去，不看還好，一看驚為天人，竟然長蜘蛛網了!? https://imgur.com/d01nT5x

(此為Seeding細胞24hr後的image) 然後稍微前後調一下焦距看起來細胞是完全沒有爬過去的，不知道是不是因為這個蜘蛛網的關係。因為自己是完全照著protocol在操作，完全想不出到底哪裡發生了問題，下面附上自己操作的詳細流程，跪求大家幫忙隔空抓藥，感謝再感謝！ 1.先將Transwell, tip, 24 well plate放進-20冰箱預冷,O/N 2.將Matrigel從-20冰箱移到冰上解凍至完全液化(大約40min) 3.將matrigel以冰的serum free medium以1:3.5的比例稀釋後，on ice 30 min 4.在chamber中加入50ul稀釋後的matrigel, 放4度冰箱15分鐘確保其完全攤平 5.移至incubator O/N使其完全固化（通常兩三個小時後和隔天都會去看一下，都還鋪得滿平滿正常的，看起來很均質，沒有任何異狀。） 6.隔天在chamber內seeding 5*10^4 in 200ul serum free medium 的細胞液 7.下層加入800ul 10%FBS complete medium, 8.Incubate 24~26小時之後以100% methanol fix後染色。以上為我詳細的操作流程，如果有需要我補充的地方歡迎大家告知，也懇請大家幫忙隔空抓藥或分享自己的經驗，看到這著蜘蛛網真是又哭又笑又不知道如何是好XDD -- ※ 發信站: 批踢踢實業坊(ptt.cc), 來自: 120.126.49.54 ※ 文章網址: https://www.ptt.cc/bbs/Biotech/M.1545459519.A.EC3.html ※ 編輯: steve42125 (120.126.49.54), 12/22/2018 14:19:25 ※ 編輯: steve42125 (120.126.49.54), 12/22/2018 14:19:43 ※ 編輯: steve42125 (120.126.49.54), 12/22/2018 14:20:58

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Tube formation是? 50ul我覺得應該還是算少的，查了不少paper好像大家都是用100ul 是怕太厚想說減半，這樣的體積厚度大概是1.5mm ※ 編輯: steve42125 (120.126.49.54), 12/22/2018 16:02:30 稍微查了一下就結果的image還真像XD，在想會不會是用的matrigel太硬了? ※ 編輯: steve42125 (120.126.49.54), 12/22/2018 16:11:01

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先謝謝您的補充，不過我所養的cell line是比較偏上皮型態的cancer cell(H1299) 在查paper的時候大家都是coating 100ul的體積（但是都沒寫是稀釋幾倍）原本擔心會爬不過去所以將厚度減半，現在可能要考慮的是將稀釋倍數拉高? ※ 編輯: steve42125 (120.126.49.54), 12/22/2018 16:15:49

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好的～謝謝您撥冗和我討論跟分享你的看法謝謝! ※ 編輯: steve42125 (36.224.17.189), 12/22/2018 19:58:43

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untilnow

12/22 21:41, 6年前 , 7^F