PTT職涯區 / Biotech (生命科學)

[求救] FPLC純化蛋白

看板Biotech (生命科學)作者時間6年前 (2019/01/24 00:53), 6年前編輯推噓6(6推 0噓 17→)
留言23則, 6人參與, 6年前最新討論串1/1
最近進行蛋白純化遇到一些問題 先前買機台的時候有教育訓練過，但年代久遠也不太常使用，實驗室其他人無相關使用經 驗，迫切求助版上高手～～～ 機型：AKTA avant Column : HIC 1_sample application 手動injection後會設定高鹽A相去洗loop 這時會有一些雜訊(導電度下降、高UV吸收)，原以為是solvent peak，但不含solvent的 樣品也有此現象，會是空氣跑進column嗎？還是純粹樣品沒binding上去?(但不懂導電度 為何會下降？)，而且收下來測濃度量也不多，有用鹼洗機台和column，但此情形沒改善Q Q 2_Elution流速會影響純化效果嗎? 目前使用流速0.6mL/min實在流太久了，想問流速增加到1-1.2mL/min是否會使binding在c olumn上的樣品，更容易被洗下來，影響純化效果？ 3_回收率 使用手動針筒loading，針筒前端會殘留，injection valve也會有一段殘留 Column用低鹽B相和水洗，UV值都在baseline上，所以應該沒卡在column上 最懷疑的就是injection後A相洗loop的不明雜訊，可是收下來測UV量也沒那麼多 想問還有哪些部分會影響回收率？ 4_剛才發生的新問題QQ 樣品injection後，高鹽洗loop時雜訊跑出來，結果UV降不下去還一直飆高(導電度維持正 常值)，以為樣品沒binding上收樣測濃度也很低，目前是先用高鹽把UV洗到baseline，再 繼續跑gradient做Elution，結果如何明天才知道，就是不知道為何UV會突然飆高啊啊啊( 崩潰) 麻煩大家了～～～謝謝～～QQ -- ※ 發信站: 批踢踢實業坊(ptt.cc), 來自: 123.195.190.114 ※ 文章網址: https://www.ptt.cc/bbs/Biotech/M.1548262382.A.24D.html
→
01/24 02:49, 6年前 , 1F
個人沒用過hic 不過經驗是流速絕對影響 前面那個peak
01/24 02:49, 1F
→
01/24 02:49, 6年前 , 2F
大概是pressure peak 回收量低很有可能是你sample loa
01/24 02:49, 2F
→
01/24 02:49, 6年前 , 3F
d太少
01/24 02:49, 3F
推
01/24 07:59, 6年前 , 4F
導電度應該是有殘留低鹽度的buffer在loop loop本身要2
01/24 07:59, 4F
→
01/24 07:59, 6年前 , 5F
-3倍體積才能完全填充 不過殘留量小不太會影響binding
01/24 07:59, 5F
→
01/24 07:59, 6年前 , 6F
01/24 07:59, 6F
推
01/24 08:02, 6年前 , 7F
另外調流速前要先看你要的peak分辨度如何 一般會先從g
01/24 08:02, 7F
→
01/24 08:02, 6年前 , 8F
radient 調完再調整流速部分
01/24 08:02, 8F
推
01/24 08:12, 6年前 , 9F
雜訊我想先不管量的問題 洗出時間在injection後 有小
01/24 08:12, 9F
→
01/24 08:12, 6年前 , 10F
於2CV 也有可能是unbinding protein 建議跑個膠check
01/24 08:12, 10F
→
01/24 08:12, 6年前 , 11F
一下 如果沒有你的target 那就不用太擔心
01/24 08:12, 11F
→
01/24 12:24, 6年前 , 12F
感謝大大們回答～～loop在使用前都有先用大於5CV的水和
01/24 12:24, 12F
→
01/24 12:24, 6年前 , 13F
大於5CV的高鹽去洗了
01/24 12:24, 13F
→
01/24 12:26, 6年前 , 14F
回收率部分，有用低鹽和水去洗，都沒洗出什麼，但用0.1N
01/24 12:26, 14F
→
01/24 12:26, 6年前 , 15F
NaOH去洗，就有高UV吸收被洗出來
01/24 12:26, 15F
→
01/24 12:27, 6年前 , 16F
看來是卡在column上QQ
01/24 12:27, 16F
→
01/24 22:16, 6年前 , 17F
只能用hic? 要不試試iex?
01/24 22:16, 17F
→
01/24 23:26, 6年前 , 18F
目前沒辦法換IEX QQ
01/24 23:26, 18F
※ 編輯: wizchoco (123.195.190.114), 01/24/2019 23:42:03 ※ 編輯: wizchoco (123.195.190.114), 01/24/2019 23:46:29
推
01/26 13:25, 6年前 , 19F
高鹽有時會造成小鹽塊析出卡在detection cell用大量水溶
01/26 13:25, 19F
→
01/26 13:25, 6年前 , 20F
解洗掉就好，之前做高鹽樣本有遇過，給您參考
01/26 13:25, 20F
推
02/02 19:02, 6年前 , 21F
恩
02/02 19:02, 21F
推
02/08 23:22, 6年前 , 22F
我這邊的業務是教說每次跑完高鹽的buffer後都要用熱
02/08 23:22, 22F
→
02/08 23:22, 6年前 , 23F
水沖一遍機器
02/08 23:22, 23F
‣ 更多 wizchoco 的文章
文章代碼(AID): #1SI9lk9D (Biotech)
Biotech 近期熱門文章
更多 近期熱門文章 >>
PTT職涯區 即時熱門文章
更多 即時熱門文章 >>
‣ 更多 wizchoco 的文章
文章代碼(AID): #1SI9lk9D (Biotech)