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[求救] Recombinant protein不表現了

看板Biotech (生命科學)作者 (drip brew)時間5年前 (2019/04/28 23:49), 編輯推噓7(7推 0噓 27→)
留言34則, 8人參與, 5年前最新討論串1/1
求救 我用E. coli overexpress recombinant protein 已穩妥使用1年吧 突然不表現了 從凍菌管重挖的也一樣 怎辦~~~~~ 我有從他的前身DH5a重抽plasmid transform到相同的表現的菌 還是無法... 其實都有表現 但量極低，純化出來只有一點點 有什麼原因或辦法嗎… 極度懊惱怎麼最重要的只有凍一管 明明其他都凍2管以上... 求救 -- ※ 發信站: 批踢踢實業坊(ptt.cc), 來自: 58.114.140.237 ※ 文章網址: https://www.ptt.cc/bbs/Biotech/M.1556466576.A.C6D.html
推
04/29 01:43, 5年前 , 1F
你有沒有檢查IPTG有沒有壞，會不會是沒有被induce?
04/29 01:43, 1F
推
04/29 09:22, 5年前 , 2F
Pellet 檢查一下 可能掉去inclusion body
04/29 09:22, 2F
推
04/29 14:33, 5年前 , 3F
樓上兩個都超有可能XD
04/29 14:33, 3F
推
04/29 21:39, 5年前 , 4F
或甚至是兩個綜合 上一管iptg掛了所以你一直都用比較
04/29 21:39, 4F
→
04/29 21:39, 5年前 , 5F
低的濃度在induce 新一管濃度對了就把蛋白全部推到ib
04/29 21:39, 5F
→
04/29 21:39, 5年前 , 6F
裡面XD
04/29 21:39, 6F
推
04/29 23:59, 5年前 , 7F
I大這描述XDD
04/29 23:59, 7F
推
04/30 11:28, 5年前 , 8F
我覺得這個論述很可以 很真實XD
04/30 11:28, 8F
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04/30 19:30, 5年前 , 9F
自己養屎汁也養好一陣子了該碰到的都碰過了XD
04/30 19:30, 9F
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04/30 23:33, 5年前 , 10F
我有positive control，IPTG沒問題，也沒在pellet裡面..
04/30 23:33, 10F
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04/30 23:33, 5年前 , 11F
. 還有什麼可能嗎…
04/30 23:33, 11F
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04/30 23:37, 5年前 , 12F
表現太好啊 降低iptg試看看
04/30 23:37, 12F
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04/30 23:41, 5年前 , 13F
之前都是用固定的濃度呀…，好哦明天做一波篩看看濃度..
04/30 23:41, 13F
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04/30 23:41, 5年前 , 14F
.
04/30 23:41, 14F
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05/01 01:23, 5年前 , 15F
先檢查有無表現，再看是在pellet還是supernant，有表現
05/01 01:23, 15F
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05/01 01:23, 5年前 , 16F
表示IPTG無問題。
05/01 01:23, 16F
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05/01 01:24, 5年前 , 17F
降低induction 濃度至0.2mM IPTG
05/01 01:24, 17F
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05/01 01:24, 5年前 , 18F
時間調整至16度C 14-16小時
05/01 01:24, 18F
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05/01 01:25, 5年前 , 19F
破菌盡量用French pressure
05/01 01:25, 19F
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05/01 01:27, 5年前 , 20F
基本上只要有表現，後續各種purify 方法都能得到蛋白，
05/01 01:27, 20F
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05/01 01:27, 5年前 , 21F
像是用Urea 破inclusion body，先Denature 再refolding
05/01 01:27, 21F
推
05/01 01:30, 5年前 , 22F
IPTG: 0.2*238.31*0.01=0.476g
05/01 01:30, 22F
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05/01 01:31, 5年前 , 23F
溶在10ml ddH2O,過0.22 micrometer filter
05/01 01:31, 23F
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05/01 01:32, 5年前 , 24F
Stock 0.2M , working 1000倍稀釋成0.2mM
05/01 01:32, 24F
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05/01 01:33, 5年前 , 25F
若這樣做還有問題歡迎站內信洽詢，能幫的都會盡量幫。
05/01 01:33, 25F
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05/01 01:36, 5年前 , 26F
記得要Re-transform 到BL-21 (DE3) ;DH5a是用來萃取plas
05/01 01:36, 26F
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05/01 01:36, 5年前 , 27F
mid DNA不能表現蛋白質
05/01 01:36, 27F
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05/01 01:37, 5年前 , 28F
還有解凍的菌液很容易跑到inclusion body
05/01 01:37, 28F
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05/01 01:38, 5年前 , 29F
盡量每次要純化蛋白都要重新re-transformation
05/01 01:38, 29F
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05/01 01:39, 5年前 , 30F
要把純化蛋白的過程，做的像製程一樣穩定。每一個環節
05/01 01:39, 30F
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05/01 01:39, 5年前 , 31F
都趨近於100%一樣。
05/01 01:39, 31F
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05/01 01:40, 5年前 , 32F
這樣純化出來的蛋白，不同的Batch才會Quality control
05/01 01:40, 32F
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05/01 01:40, 5年前 , 33F
很穩定。
05/01 01:40, 33F
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06/14 08:17, 5年前 , 34F
重新晝菌了啦！
06/14 08:17, 34F
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