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[求救] 貼附細胞的免疫螢光染色已刪文

看板Biotech (生命科學)作者 (我還有點餓)時間5年前 (2019/05/02 02:37), 5年前編輯推噓8(8推 0噓 19→)
留言27則, 6人參與, 5年前最新討論串1/1
各位前輩好 小妹最近在做貼附型細胞的螢光染色 但常常染不上東西 不曉得是不是有沒有什麼地方沒有注意到 我的染劑有mitotracker綠 、Phalloidin紅以及DAPI 步驟是 抽掉medium後 PBS wash 3次 下mitotracker 避光反應30分鐘（放回培養箱） 抽掉染劑 PBS wash 3次 4% PFA 反應15分鐘（放回培養箱） PBS wash 3次 0.1% triton x 反應5分鐘（放回培養箱） PBS wash 3次 Phalloidin 20分鐘（放回培養箱） PBS wash 3次 DAPI 5分鐘（放回培養箱） PBS wash 3次後再補PBS下去拍螢光 附上最近一次染的好像有點成功又有點失敗的圖 https://i.imgur.com/BHUCXze.jpg
完全看不到綠螢光.... 先謝謝各位前輩 -- ※ 發信站: 批踢踢實業坊(ptt.cc), 來自: 114.136.180.57 ※ 文章網址: https://www.ptt.cc/bbs/Biotech/M.1556735836.A.6A0.html
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05/02 10:13, 5年前 , 1F
你先用live cell染染看mitotracker，如果會亮代表他不能
05/02 10:13, 1F
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05/02 10:13, 5年前 , 2F
用pfa fix
05/02 10:13, 2F
live cell 有亮 但因為沒有做到後續的骨架跟核所以沒有固定跟打洞的問題
推
05/02 12:00, 5年前 , 3F
我記得mitotracker green好像就是不能用PFA
05/02 12:00, 3F
Protocol 是說do not fix,但因為我還要做phalloidin 跟DAPI 這兩個都需要PFA跟Trito n x 所以不知道該怎麼辦才好 ※ 編輯: couragechi (114.136.180.57), 05/02/2019 15:01:18
推
05/02 15:42, 5年前 , 4F
1. fix後染色不用 37度 ，RT 即可 2. Phalloidin
05/02 15:42, 4F
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05/02 15:42, 5年前 , 5F
染色時間可以0.5h-1h，會比較漂亮 3. 可用抗體染 mi
05/02 15:42, 5F
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05/02 15:42, 5年前 , 6F
tochondria (如 Tom20/HSP60等)
05/02 15:42, 6F
沒有錢可以買抗體:( lab只有mitotracker可以用. 請問除了溫度的部分其他步驟是沒有問題的嗎？ ※ 編輯: couragechi (114.136.180.57), 05/02/2019 16:07:25
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05/02 17:37, 5年前 , 7F
其實你的實驗結果已經告訴你 fix就是問題所在了
05/02 17:37, 7F
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05/02 17:40, 5年前 , 8F
所以現在要一起看的話，就是像tynse71864說的換成抗體囉
05/02 17:40, 8F
推
05/03 00:59, 5年前 , 9F
如同 J 大說的 mitotracker應是買到不能fix 的，除了
05/03 00:59, 9F
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05/03 00:59, 5年前 , 10F
換一種可以 fix的，就是換抗體； 兩者都要花錢囉
05/03 00:59, 10F
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05/03 00:59, 5年前 , 11F
抗體也沒很貴啊 我說的那幾隻都有小包裝 3-5k 可
05/03 00:59, 11F
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05/03 00:59, 5年前 , 12F
能就有了
05/03 00:59, 12F
謝謝前面兩位前輩的建議，因為實驗室只有我在做細胞的部分，所以能不多花錢就不花錢 囉畢竟我們實驗室有點窮
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05/03 01:28, 5年前 , 13F
mitotracker green不能固定，你只能改用其他染劑
05/03 01:28, 13F
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05/03 01:29, 5年前 , 14F
data sheet有說哪些可以mitotracker可以固定
05/03 01:29, 14F
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05/03 01:30, 5年前 , 15F
供你參考
05/03 01:30, 15F
因為有看到其他protocol 說可以fix所以才這樣做的
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05/03 01:56, 5年前 , 16F
dapi其實不用fix 多加一點就好
05/03 01:56, 16F
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05/03 01:58, 5年前 , 17F
你看起來好像也沒有一定得做mito+phal的colocalisatio
05/03 01:58, 17F
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05/03 01:58, 5年前 , 18F
n 就分開做唄?
05/03 01:58, 18F
之前試做的時候是分開做的，但分開做拍照也是一個問題所在，我會再思考看看 ※ 編輯: couragechi (223.140.213.238), 05/03/2019 03:23:52
推
05/03 15:42, 5年前 , 19F
DAPI染不太了活細胞吧,要用 Hochest
05/03 15:42, 19F
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05/03 16:06, 5年前 , 20F
可以喔 就加 但是那批大概會被毒死XD
05/03 16:06, 20F
推
05/05 18:50, 5年前 , 21F
請問一下DAPI活染濃度要多少呀 我用1ug/ml染15分鐘還是染
05/05 18:50, 21F
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05/05 18:50, 5年前 , 22F
不太上去顏色很淡而且背景很髒
05/05 18:50, 22F
推
05/05 22:45, 5年前 , 23F
染不上去請換 Hochest辣, DAPI正常情況進不去活細胞的
05/05 22:45, 23F
推
05/07 23:09, 5年前 , 24F
樓上是對的, 有hoechst就用, 沒有又買不到急用可以試d
05/07 23:09, 24F
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05/07 23:09, 5年前 , 25F
api. 高濃度染到一個小時看看
05/07 23:09, 25F
但我有問題，PFA下去的話細胞不就死亡了嗎？ 另外想再請問 triton x下去把細胞打爛的機會有多高呀 ※ 編輯: couragechi (223.136.131.203), 05/08/2019 01:06:59
推
05/08 02:24, 5年前 , 26F
tx100活的打大概30秒吧
05/08 02:24, 26F
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05/08 03:12, 5年前 , 27F
活染的意思就是不要下pfa直接下hoechst跟mito
05/08 03:12, 27F
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