[求救] Spheroid single cell離不下來

看板Biotech (生命科學)作者steve42125 (Shiburin)時間5年前 (2019/05/18 17:20)推噓4(4推 0噓 6→)

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各位好最近想要將培養好的Spheroid cell打散成Single cell後用Flow cytometry做分析打散的部分是用Accutase常溫處理，在顯微鏡下觀察打散的效果還不錯但是離心1250rpm, 5min之後發現Pellet有明顯縮小的情形這邊還不打緊硬是取了需要的細胞數到Eppendorf後準備離心進行Fix 這邊原本是用300g, 5min 但發現奇怪的是有的細胞離得下來變成pellet，有的細胞的pellet會在管壁上排列形成一條線，有的離完甚至看不到Pellet，事實上在打散Spheroid cell之後可以看到細胞明顯變小，有試過把離心速度和時間都慢慢往上調甚至調到了3500g, 10min (對你沒看錯) 還是沒辦法讓細胞在底部形成pellet 有試過將15ml離心管跟Eppendorf都先用2.5%BSA/PBS coating 但是好像沒有太好的效果...... 想請問有做過這方面實驗或是對Flow的操作流程有經驗的各位可以提出我可能需要更改的條件不然每次養了兩三個禮拜的Spheroid都被Eppendorf吃光根本QQ -- ※ 發信站: 批踢踢實業坊(ptt.cc), 來自: 120.126.49.54 ※ 文章網址: https://www.ptt.cc/bbs/Biotech/M.1558171249.A.8AF.html

推

tynse71864

05/18 20:49, 5年前 , 1^F

05/18 20:49, 1^F

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tynse71864

05/18 20:49, 5年前 , 2^F

05/18 20:49, 2^F

確實是，應該說Accutase終止反應只需要用5倍體積的PBS稀釋就可以所以加入PBS之後還是需要離心重懸計數，取細胞到Eppendorf後再離心才開始固定跟染色 (我是要染Intracellular所以要先固定+打洞)，就是在最後這邊離心一直離不下來.... 因為之前都是染一般貼附型的細胞都可以用正常的量去染(1*10^6)就沒遇過這種問題 Spheroid single cell的細胞數很少所以最多都只能用2.5*10^5，才遇到這個情況.... ※ 編輯: steve42125 (36.224.21.211), 05/18/2019 21:18:12