[求救] EMSA 跑完只看到很淡的free probe
大家好，以下是我的實驗設置：
Probe 是從一般PCR primer 開始，分別forward和reverse (36bp)，使用3’end DNA labeling kit，最後等量混合兩者，用PCR儀從90度等梯度降溫30分鐘，室溫靜置一小時後分裝，-20度保存。
核蛋白是從90%細胞匯集度100mm dish上用nuclear extract kit收集的，按說明書操作最後分裝-80度保存。
以下是我每一孔的配置，最後三孔是按照廠商給的說明書配的。
https://i.imgur.com/il7bnSR.jpg
(WT: wild type/ MT: mutant)
我的實驗結果如下：
https://i.imgur.com/RQNQLI0.jpg
（曝光時間30sec vs 3sec)
最右邊三孔是照廠商給的說明書按表操課完全沒問題，但是左邊我自己做到的部分我不知道那邊可能弄錯了，只看到很淡的free probe。
探針濃度應該已經超級高了，probe final con. 5nM，廠商給的建議終濃度只需要20fM。
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