[求救] Primary culture

看板Biotech (生命科學)作者MLSHBen (酷喔)時間5年前 (2019/11/20 20:16)推噓3(3推 0噓 3→)

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大家好最近老師要我從合作醫生那邊取得的抽脂液 (liposuction)分離脂肪幹細胞之前沒做過primary cell culture，所以有一些問題想請教一下板上的大大們先列一下我的步驟 (參考一些paper後整理出來)： 1. 抽脂液放冰上送往實驗室 2. 倒至50 ml離心管至20~25 ml左右高度，加入HBSS至50 ml，搖晃以wash 3. 離心：500 G 10分鐘 4. 以pipet將脂肪組織下的HBSS完全吸掉 5. 重複2.~4.以HBSS再wash一次 (若還有紅色液體 (可能是血液之類的)殘留則再繼續wash，避免影響collagenase作用) 6. 加入collagenase type I (量至少蓋過離心下來的脂肪組織) (2 mg/ml in HBSS, 300 U/mg, 0.22-um low protein binding filtered) 7. 37度水浴30~60分鐘，每5~10分鐘invert 5次 8. 加入等體積培養液 (alpha-MEM with 10% FBS, 1% PS)以中和collagenase 9. 離心：600 G 10分鐘，倒掉上清液 10. 加入10 ml ACK lysing buffer至pellet，室溫靜置5分鐘以溶掉紅血球 11. 離心：300 G 5分鐘，倒掉上清液 12. 以1 ml培養液回溶pellet，加入適當體積培養液後混勻，過40-um細胞過濾器 13. 加至適當dish或flask 14. 隔天將懸浮細胞吸掉，以PBS wash後換新培養液步驟大概如上想問的是 1. 檢體的運送查過網路上的primary cell culture的經驗分享大多是建議現採現做，但由於醫院和實驗室有約1小時車程的距離所以打算讓它保存在4度的狀態運回實驗室 (以前實驗室學姐有教離心管內的細胞如果暫時沒做實驗可以放冰上，但好像不能放太久...) 但回去可能很晚無法做實驗了有看到說法是可以放4度24~72小時，不知道正不正確... 所以想請教一下運送和保存的條件是否可以放4度？ (可以的話我不會讓其超過24小時) 有經驗是不建議凍存 (-20或-80度)，理由是產生的冰晶會破壞細胞 2. collagenase type I的濃度看過有的paper是寫0.075%，有的是寫2 mg/ml 但具體作用好像是看digestion unit 但大家paper都沒寫，而每次廠商出貨的品質也不盡相同 (每批貨的digestion unit不會一樣) 想請問我這濃度是否OK？ 3. 離心轉速看過有的paper寫是用300 G，有的是用600 G 以前離心細胞都是用400 G (跟300 G差100 rpm) 不知道離心用600 G是否OK？大概是這幾個問題想請教板上的大大先謝謝大家了 -- ※ 發信站: 批踢踢實業坊(ptt.cc), 來自: 111.243.53.238 (臺灣) ※ 文章網址: https://www.ptt.cc/bbs/Biotech/M.1574252176.A.B32.html