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[求救] western 壓片疑惑

看板Biotech (生命科學)作者 (珼珼)時間5年前 (2019/12/10 18:36), 5年前編輯推噓18(18推 0噓 30→)
留言48則, 19人參與, 5年前最新討論串1/1
各位版大好 小的對於western blot可以說是非常之不擅長 在博班學長的帶領下data終於有稍稍好轉的跡象 但目前遇到不知該如何解決的問題 以下是實驗條件 Sample: 80ug 6xDye 煮6分鐘 -20保存 Running: 上膠 70v 30mins 下膠 120v 90mins 15% Transfer: 濕式 300mA 90mins PVDF 膜 100%甲醇 泡10mins以上 Transfer buffer(1:2:7=10xbuffer:甲醇：水） Buffer會冰-20兩個小時(重複使用最多三次） 跑的時候有放冰保 跑的時候有放冰保 跑的時候有放冰保 Tank外有放冰塊保冷 Blocking: 5%脫脂牛奶 1小時 （TBST 洗3次，每次10分鐘） 1抗: 1抗: 4度c over night (抗體會重複使用） （TBST 洗3次，每次10分鐘） （TBST 洗3次，每次10分鐘） 2抗: TBST 稀釋至 1:5000 室溫 1小時 （TBST 洗3次，每次10分鐘） 以下是實驗結果 https://i.imgur.com/g8oKfvP.jpg
https://i.imgur.com/c2tc9g4.jpg
圖片可以看到 圖片可以看到 在應該是蛋白的位置上有長長一條 不然就是像圖二的情形 我在壓Twist,snai1,slug的時候 常常有這種情況 不然就是全白沒有band 小的完全不知道該如何改善這件事情 請各位大大指點迷津 附上actin的data給各位參考一下 2抗稀釋至 1:10000 https://i.imgur.com/5TzimNi.jpg
-- -- ※ 發信站: 批踢踢實業坊(ptt.cc), 來自: 180.217.230.109 (臺灣)
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12/10 18:46, 5年前 , 1F
上膠 0 V ????? 這是在跑身體健康的喔XDDDD
12/10 18:46, 1F
阿哈哈哈哈為什麼我的7被消掉了，抱歉抱歉 ※ 編輯: zzxc87520 (180.217.230.109 臺灣), 12/10/2019 18:48:19
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12/10 18:48, 5年前 , 2F
你的學長做的western有這些問題嗎？單看你的步驟其實少
12/10 18:48, 2F
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12/10 18:48, 5年前 , 3F
你的學長做的western有這些問題嗎？單看你的步驟其實少
12/10 18:48, 3F
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12/10 18:49, 5年前 , 4F
掉了一些重要的過程，是沒寫還是真的沒有？
12/10 18:49, 4F
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12/10 18:50, 5年前 , 5F
(如：PVDF先浸甲醇再拿來transfer)
12/10 18:50, 5F
回x大，學長本人不跑western ，同學跟學妹的片子有問題大部分是背景髒或空白片，其他都是清晰的band。 ※ 編輯: zzxc87520 (180.217.230.109 臺灣), 12/10/2019 18:56:03
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12/10 18:52, 5年前 , 6F
然後我第一次看到有6x的SDS loading dye。還有二抗應該
12/10 18:52, 6F
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12/10 18:53, 5年前 , 7F
也是要在牛奶裡吧怎麼會是TBST？不過這大概都不是主因
12/10 18:53, 7F
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12/10 18:53, 5年前 , 8F
，你的問題比較像在transfer(包含)之前的問題
12/10 18:53, 8F
回x大，2抗會在TBST裡是有老師建議，說是背景會比較乾淨，但小的覺得沒什麼差別，通常沒有data都是空白片，6xdye是學長給的配方，我們是自己配的，實驗室都是用這個跑的。 ※ 編輯: zzxc87520 (180.217.230.109 臺灣), 12/10/2019 19:05:23 ※ 編輯: zzxc87520 (180.217.230.109 臺灣), 12/10/2019 19:06:49
推
12/10 19:25, 5年前 , 9F
問一下 一抗有說要用BSA泡嗎？
12/10 19:25, 9F
推
12/10 19:54, 5年前 , 10F
actin很美啊流程應該沒有問題 確定有表現嗎 不然就是
12/10 19:54, 10F
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12/10 19:54, 5年前 , 11F
抗體需要特殊處理 要不要一抗番號來一下看有沒前輩有
12/10 19:54, 11F
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12/10 19:54, 5年前 , 12F
經驗的
12/10 19:54, 12F
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12/10 20:55, 5年前 , 13F
你把b-actin跑膠的條件membrane拿去染snail應該就好了
12/10 20:55, 13F
回b大，我的actin跟snail是同一片膠，所以snail染成這樣我才覺得很疑惑。 ※ 編輯: zzxc87520 (180.217.230.109 臺灣), 12/10/2019 21:45:16
推
12/10 23:37, 5年前 , 14F
要不要改用bsa blocking & 配一抗試試，流程挺一般的沒啥問
12/10 23:37, 14F
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12/10 23:37, 5年前 , 15F
題
12/10 23:37, 15F
推
12/10 23:41, 5年前 , 16F
pvdf甲醇不用泡十分鐘吧，浸一下就好
12/10 23:41, 16F
推
12/11 01:05, 5年前 , 17F
推Ianthegood，beta-actin很美，跑膠應該沒問題，若抗體都有
12/11 01:05, 17F
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12/11 01:05, 5年前 , 18F
照datasheet配置及反應，可能是target protein表現量低於偵測
12/11 01:05, 18F
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12/11 01:05, 5年前 , 19F
極限，用recombinant protein或確定有表現的樣品做positive
12/11 01:05, 19F
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12/11 01:05, 5年前 , 20F
control就能確定了
12/11 01:05, 20F
推
12/11 11:41, 5年前 , 21F
拿一抗說明書寫的比例與buf試試吧！現在還有實驗室在壓
12/11 11:41, 21F
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12/11 11:41, 5年前 , 22F
片？？
12/11 11:41, 22F
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12/11 23:27, 5年前 , 23F
我們所很多都還是用壓的阿
12/11 23:27, 23F
推
12/12 00:33, 5年前 , 24F
Datasheet的常不準阿,不同廠商的膜也有差
12/12 00:33, 24F
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12/12 00:34, 5年前 , 25F
背景霧狀表示二抗5000有點太高,訊號不好增加1抗看看
12/12 00:34, 25F
推
12/12 18:26, 5年前 , 26F
現在已經有不少便宜的掃描機器，足夠一般學術單位使用了
12/12 18:26, 26F
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12/13 10:56, 5年前 , 27F
transfer完，可以先染個ponceau S，確認transfer有做
12/13 10:56, 27F
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12/13 10:56, 5年前 , 28F
成功。我跑transfer會穩壓75V，好像不是用穩流跑耶。如
12/13 10:56, 28F
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12/13 10:56, 5年前 , 29F
果確定transfer有成功，可能是抗體的問題，抗體搖太久
12/13 10:56, 29F
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12/13 10:56, 5年前 , 30F
或是抗體專一性不夠。
12/13 10:56, 30F
推
12/14 18:58, 5年前 , 31F
底片的sensitivity是無法取代的 沒有人isotope用掃描
12/14 18:58, 31F
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12/14 18:58, 5年前 , 32F
機做的
12/14 18:58, 32F
推
12/14 20:26, 5年前 , 33F
掃描機用久很懷念洗片阿
12/14 20:26, 33F
推
12/14 20:29, 5年前 , 34F
另，原po的三隻抗體 (除了 actin) 都確定可以用嗎？
12/14 20:29, 34F
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12/14 20:31, 5年前 , 35F
有些抗體reuse效果也會變很差，是否這個原因造成的？
12/14 20:31, 35F
推
12/15 13:13, 5年前 , 36F
actin很漂亮步驟應該沒問題 感覺抗體不要重複用拿新的會
12/15 13:13, 36F
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12/15 13:13, 5年前 , 37F
比較好嗎 或是蛋白純化過程是不是有問題？
12/15 13:13, 37F
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12/15 13:15, 5年前 , 38F
煮的時間可以拉長？
12/15 13:15, 38F
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12/15 13:15, 5年前 , 39F
或是samplebuf配方是？有sds膠當對照嗎
12/15 13:15, 39F
推
12/15 17:57, 5年前 , 40F
或甚至不要煮熟 70-80度就好?
12/15 17:57, 40F
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12/16 00:48, 5年前 , 41F
我覺得twist本身就不是很好壓，我們實驗室換過多家抗體
12/16 00:48, 41F
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12/16 00:48, 5年前 , 42F
才找到一個堪用的~ 所以你要不要多試幾家抗體看看？
12/16 00:48, 42F
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12/16 00:49, 5年前 , 43F
btw 然後twist的1抗我會稍微配濃一點
12/16 00:49, 43F
推
12/18 20:20, 5年前 , 44F
有沒有想過是抗體爛
12/18 20:20, 44F
推
12/26 18:18, 5年前 , 45F
有這個抗體的+ctrl嗎? 直覺是抗體不好
12/26 18:18, 45F
推
01/01 18:58, 6年前 , 46F
actin看來沒什麼問題 抗體爛或是sample表達少的機率高
01/01 18:58, 46F
推
02/01 06:46, 5年前 , 47F
transfer沒成功會連actin都壓不好啦......
02/01 06:46, 47F
推
03/28 17:28, 5年前 , 48F
把那三隻的抗體編號放上來吧......
03/28 17:28, 48F
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