[求救] 銀染問題請益

看板Biotech (生命科學)作者evayoyo時間5年前 (2020/01/15 22:25)推噓0(0推 0噓 14→)

留言14則, 1人參與討論串1/1

各位前輩好最近做co-ip跑銀染時band都不是很理想想麻煩前輩們幫忙看看是不是哪裡出問題> < 感激不盡！！簡述co-ip做法：先用protein A的beads binding antibody 再加入protein lysate mix overnight 隔天再用sample buffer 煮100度10分鐘elution 跑膠load sample時會連磁珠一起下去跑曾經有使用過total protein lysate去做coip並染coomassie blue（步驟與前述都相同）有band但感覺雜band超級多 https://i.imgur.com/lRODvjd.jpg

後來改抽membrane protein去做coip 用的是Thermo的MEM-PER plus kit 下800mg的protein去做binding 第一次做沒有測elute出來的蛋白濃度下20ul含beads去染銀染銀染用Thermo的silver stain for mass spec kit做 band的深淺看起來超不穩定右方兩組是IgG 其他都是實驗組 https://i.imgur.com/8WPv78E.jpg

第二次做有測濃度最後elute出來的蛋白濃度約0.3mg/ul 下40ul含beads去染銀染右方兩組是input 中間兩組是IgG 左方兩組是我的實驗組 https://i.imgur.com/GhR5puJ.jpg

第二次下的量明明比較多但看到的band卻比較少看最上方好像是都卡住沒有跑下來 ( ? 猜測可能的問題有 1.膠體配錯 2.磁珠太多 3.elution用的sample buffer elute不下來但先前染coomassie blue步驟一樣好像也沒這個問題麻煩各位救救我了謝謝！！！！！！！！ -- ※ 發信站: 批踢踢實業坊(ptt.cc), 來自: 140.112.122.220 (臺灣) ※ 文章網址: https://www.ptt.cc/bbs/Biotech/M.1579098346.A.6DF.html ※ 編輯: evayoyo (140.112.122.220 臺灣), 01/15/2020 22:27:26 ※ 編輯: evayoyo (140.112.122.220 臺灣), 01/15/2020 22:28:05 ※ 編輯: evayoyo (140.112.122.220 臺灣), 01/15/2020 22:29:46 ※ 編輯: evayoyo (140.112.122.220 臺灣), 01/15/2020 22:31:54

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想請教跑出來的band這麼奇怪會是因為上方卡了很多像蛋白的東西沒有完整跑下來嗎？有的我有wash，但是是用PBS wash，當初是另一個實驗室的學姐建議的，她有這樣做過說沒有問題。請問要怎麼確定飽和呢？抱歉我是新手問題很多QQ 我coip抓下來的東西有去壓western 也有看到我目標蛋白的band，但在銀染的圖中該位置卻沒有看到band，謝謝你的建議！但是現在銀染都沒有band QQ ※ 編輯: evayoyo (101.15.140.197 臺灣), 01/16/2020 02:34:41

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