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[求救] 用Strep-tactin純化蛋白一直有雜band

看板Biotech (生命科學)作者 (Never give up!!)時間4年前 (2020/09/08 02:43), 4年前編輯推噓2(2推 0噓 5→)
留言7則, 2人參與, 4年前最新討論串1/1
實驗室學長之前用His tag系統純化同一種蛋白有成功純化出來 但我改用Strep-tactin 管柱純化該蛋白之後，elude出來跑SDS-PAGE的結果卻一直都有雜 band 第二次做把washing buffer的體積提高到兩倍 跑膠結果依然有雜band 而且這條band Mr還比我的目標蛋白來得大 所以應該也不可能會是degrate後的產物或是aggregate的結果(以跑SDS) 因此很有可能根本是其他蛋白，甚至第一次跑SDS PAGE的band還比我的目標蛋白還深一點 這非常不合理 一直覺得很困惑這條雜band究竟是怎麼來的，因為這種新式管柱不像之前學長用的可以在 wash時調整imidazole的濃度 唯一能改變的變因只有加大washing buffer的體積，但改了之後結果卻還是一樣 討論的結果覺得可能是管柱本身親和性太強以致於抓到其他有非目標蛋白（但很不確定） 而且它喧賓奪主變成major band也是很匪夷所思 想問大家有沒有類似的經驗能提供我一點改善的idea呢？查資料好像也沒有特別針對stre p-tactin這套系統調整protocol的資料......菜鳥碩一生真的想破頭了QQ -- ※ 發信站: 批踢踢實業坊(ptt.cc), 來自: 223.137.169.232 (臺灣) ※ 文章網址: https://www.ptt.cc/bbs/Biotech/M.1599504230.A.90D.html ※ 編輯: lovelylc (223.137.169.232 臺灣), 09/08/2020 02:49:09
推
09/08 10:09, 4年前 , 1F
首先strep 的nonspecific 不是Ni binding protein建議
09/08 10:09, 1F
→
09/08 10:09, 4年前 , 2F
你先看清楚strep的原理 這類peptide affinity 一般是
09/08 10:09, 2F
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09/08 10:09, 4年前 , 3F
利用氫鍵所以可以利用調整salt濃度來改善 此外 strep
09/08 10:09, 3F
→
09/08 10:09, 4年前 , 4F
elution 也是利用競爭型所以也可以拉elution 強度來區
09/08 10:09, 4F
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09/08 10:09, 4年前 , 5F
分
09/08 10:09, 5F
嗯嗯嗯謝謝你的建議，我再好好研究一下！ ※ 編輯: lovelylc (223.136.81.92 臺灣), 09/08/2020 11:20:10
推
09/09 00:07, 4年前 , 6F
1.鹽 2.imidazole 3.pH 要動binding跟washing buffer
09/09 00:07, 6F
→
09/09 00:08, 4年前 , 7F
啊sorry沒有imidazole
09/09 00:08, 7F
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