[求救] T4 DNA ligation

看板Biotech (生命科學)作者janewu945 (I am who I am)時間4年前 (2020/09/10 02:11)推噓3(3推 0噓 11→)

留言14則, 5人參與討論串1/1

前提 Vector : pET28b （裡面包含其他東西，總共6019bp），想切除NdeI&BamHI(30bp)，再將 insert接入 Insert : 為老鼠基因在pCMV3上（900bp) (restriction cut : NdeI&BamHI ) 小妹我最近在做T4 ligase狀況很多 ........................................................ Vector 在單切NdeI 時會多一條band https://i.imgur.com/5quBTRl.jpg

做完ligations 時，一樣有那條band卻導致位置完全不一樣預計切完時vector為6000bp , insert 為1000bp 卻在3000時有兩個band....= = Insert卻只有750bp （圖為RE CUT 做確認是否有無接上） https://i.imgur.com/eG3BTM5.jpg

想問看看大家有沒有這樣多問題 NdeI那邊是ghost band嗎？我已經不知道該怎麼辦了......= = Insert有換了新的primer做還是一樣 -- ※ 發信站: 批踢踢實業坊(ptt.cc), 來自: 49.216.167.79 (臺灣) ※ 文章網址: https://www.ptt.cc/bbs/Biotech/M.1599675087.A.EE8.html ※ 編輯: janewu945 (49.216.167.79 臺灣), 09/10/2020 02:13:10

推

ldy

09/10 02:58, 4年前 , 1^F

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roy047

09/10 05:00, 4年前 , 2^F

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挑20顆菌的狀況都一模一樣，會有這種狀況嗎......囧 ※ 編輯: janewu945 (49.216.167.79 臺灣), 09/10/2020 09:00:34

推

blence

09/10 13:38, 4年前 , 3^F

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blence

09/10 13:39, 4年前 , 4^F

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blence

09/10 13:40, 4年前 , 5^F

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Vector裡面已接進去的insert沒有NdeI的切位 restriction enzyme都是跟NEB，是這一月買的。 vector實驗順序 A. re cut 1.NdeI(incubate at 37C for 1hr & heat inactive at 37C for 20min) 2.BamHI (incubate at 37C for 1 hr) B. Gel extraction 再去測濃度完做T4 ligations ※ 編輯: janewu945 (49.216.167.79 臺灣), 09/10/2020 14:11:38

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blence

09/10 22:52, 4年前 , 6^F

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xxtomnyxx

09/11 11:07, 4年前 , 7^F

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xxtomnyxx

09/11 11:07, 4年前 , 8^F

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