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[求救]T4 ligation

看板Biotech (生命科學)作者 (I am who I am)時間4年前 (2020/09/14 23:02), 4年前編輯推噓3(3推 0噓 11→)
留言14則, 6人參與, 4年前最新討論串1/1
小妹上次的vector 重新跑之後就沒有雙band 的問題 但是在做ligations 卻出現跟之前一樣狀況 Ligations 完後跑NdeI&XhoI去確認insert 是否有進去 預期位置是6000bp 與1500bp 卻跑出來4000bp的位置且沒有切出東西 https://i.imgur.com/im1xZAJ.jpg
實驗順序 Vector Re digestion(incubate 37C 1hr)> gel extraction > CIP(37C 10min , 80C 2min) > T4 ligations (RT10min) Insert PCR > Gel extraction > RE Digestion(incubate 37C 1hr)> Gel extraction > T4 ligations 在ligations前 跑膠位置都正確 現在只有想到是問題狀況是 1.transform不完全導致後面ligations 出問題 2.ligations 時間太少（依照NEB Protocol) 3.前面NdeI的RE digestion 時間需要更長（2hr up?) 我很想送定序但老闆只要聽到定序兩個字就會炸掉QQ 想問看看大家做實驗的狀況 -- ※ 發信站: 批踢踢實業坊(ptt.cc), 來自: 101.12.192.114 (臺灣) ※ 文章網址: https://www.ptt.cc/bbs/Biotech/M.1600095763.A.C6B.html ※ 編輯: janewu945 (101.12.192.114 臺灣), 09/14/2020 23:03:06
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所以你到底是ligate完跑膠還是ligation/transformation/RE完跑膠啊
我看不懂 09/15 00:09 實驗順序都是在ligation前，之後再做transformation ※ 編輯: janewu945 (220.133.82.62 臺灣), 09/15/2020 00:28:28
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09/15 02:42, 4年前 , 2F
所以你為什麼不transform啊
09/15 02:42, 2F
推
09/15 04:16, 4年前 , 3F
同意樓上，不是應該ligation完直接transform，挑col
09/15 04:16, 3F
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09/15 04:16, 4年前 , 4F
ony抽plasmid出來RE跑膠嗎
09/15 04:16, 4F
推
09/15 04:20, 4年前 , 5F
以前做T4 ligation都是放16 ℃ o/n
09/15 04:20, 5F
推
09/15 12:43, 4年前 , 6F
挑完菌再切吧，然後建議選別的切位測試
09/15 12:43, 6F
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09/15 12:44, 4年前 , 7F
ligation的產物又切同樣酵素不就insert跟vector混合物
09/15 12:44, 7F
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09/15 12:44, 4年前 , 8F
嗎
09/15 12:44, 8F
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09/15 13:01, 4年前 , 9F
T4接完如果可以讓你看到這麼多circular,那幹嘛用這麼多DNA
09/15 13:01, 9F
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09/15 13:01, 4年前 , 10F
去做,只要picogram的量就夠了阿
09/15 13:01, 10F
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09/15 14:29, 4年前 , 11F
晚點有時間的話我回一篇好了，妳的實驗設計漏了不少東
09/15 14:29, 11F
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09/15 14:29, 4年前 , 12F
西，看這結果很難回答出什麼。
09/15 14:29, 12F
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09/20 18:44, 4年前 , 13F
Insert 在 PCR完後過column先切，不要跑膠後再切又再跑膠收
09/20 18:44, 13F
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09/20 18:44, 4年前 , 14F
集。
09/20 18:44, 14F
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