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WB蛋白跑不下去

看板Biotech (生命科學)作者 (哇哈哈)時間3年前 (2021/04/27 14:35), 編輯推噓5(5推 0噓 17→)
留言22則, 8人參與, 3年前最新討論串1/1
求救 https://imgur.com/a/i033WuH 最近跑的WB都呈現這樣子， 壓得抗體已經是GAPDH， 但顯色的地方也不是目標分子量， 跑了好幾片都長這樣 （顯色有高有低，但都很醜，位置也不對） sample是細胞蛋白 上膠 80V 160mA 下膠 120V 160mA Running buffer:Tris Base 30g+glycine 144g+SDS 10ml 定容到1L Transfer是半乾式，30V 400mA 1小時15分 看起來像蛋白沒有跑下去（？ 但marker和dye都有跑到底了 會是sample沒有變性嗎？ ----- Sent from JPTT on my iPhone -- ※ 發信站: 批踢踢實業坊(ptt.cc), 來自: 114.137.119.140 (臺灣) ※ 文章網址: https://www.ptt.cc/bbs/Biotech/M.1619505346.A.B71.html
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04/27 17:44, 3年前 , 1F
transfer沒壓緊
04/27 17:44, 1F
推
04/27 17:46, 3年前 , 2F
上下膠pH有對嗎？
04/27 17:46, 2F
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04/27 20:02, 3年前 , 3F
running buffer顯然不對
04/27 20:02, 3F
推
04/27 22:13, 3年前 , 4F
應該是running buffer的問題
04/27 22:13, 4F
推
04/28 00:45, 3年前 , 5F
Running buffer配方看起來是10X的...
04/28 00:45, 5F
推
04/28 01:24, 3年前 , 6F
你算一下你的tris是0.25M，glycine1.92M，SDS用100%
04/28 01:24, 6F
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04/28 01:24, 3年前 , 7F
配完是1%，這是10Xbuffer的濃度，pH要調到8.3，tris
04/28 01:24, 7F
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04/28 01:24, 3年前 , 8F
base非常鹼
04/28 01:24, 8F
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04/28 02:10, 3年前 , 9F
SDS沒有100%啦，水溶液最多也20%，假設是10%那SDS濃度
04/28 02:10, 9F
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04/28 02:10, 3年前 , 10F
是對的。Tris-Glycine-SDS的配方是25 mM Tris base, 1
04/28 02:10, 10F
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04/28 02:10, 3年前 , 11F
92 mM Glycine, 0.1% SDS。Tris base 也有用 24.76 mM
04/28 02:10, 11F
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04/28 02:10, 3年前 , 12F
的就是 1 L加30克比較好秤。然後我個人強烈建議「不要
04/28 02:10, 12F
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04/28 02:10, 3年前 , 13F
調pH！」就算要調也絕對不要用 HCl 或 NaOH 調，請用G
04/28 02:10, 13F
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04/28 02:10, 3年前 , 14F
lycine或Tris base 調pH。
04/28 02:10, 14F
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04/28 06:59, 3年前 , 15F
SDS也是鹼,沒事別調pH,直接用就好
04/28 06:59, 15F
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04/28 07:00, 3年前 , 16F
產生的鹽跑膠時讓buffer過熱,只能用低電壓慢慢跑
04/28 07:00, 16F
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04/28 11:10, 3年前 , 17F
對對 running buffer是10倍的 用之前稀釋成1倍 沒有調pH
04/28 11:10, 17F
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04/28 11:10, 3年前 , 18F
值
04/28 11:10, 18F
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04/28 22:14, 3年前 , 19F
如果你上面寫的那個 1 L 是10倍的配法，假設你的SDS 10
04/28 22:14, 19F
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04/28 22:15, 3年前 , 20F
mL 是指 10% SDS 加 10 mL，那你的 1 倍溶液中的 SDS就
04/28 22:15, 20F
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04/28 22:15, 3年前 , 21F
只有標準的 1/10....
04/28 22:15, 21F
推
04/29 17:39, 3年前 , 22F
dye有跟sample混在一起再加熱變性過吧？
04/29 17:39, 22F
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