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[求救] .22 PVDF 與 >100kda protein

看板Biotech (生命科學)作者 (Shiburin)時間3年前 (2021/07/25 14:05), 3年前編輯推噓6(6推 0噓 22→)
留言28則, 8人參與, 3年前最新討論串1/1
想請問關於PVDF pore size和protein size 有點好笑(?)的問題 實驗室最近想壓一個約15kda的protein 原本用.45 PVDF壓出來的效果覺得不是很好 有聽過說壓小分子protein可以選擇用.22 um的會比較好 但是因為同時會需要看約130kda的protein 想請問會有可能因為換了.22 PVDF後導致大protein卡不進洞裡(?)而tran不過去 或是因為其他的原因使得大protein變得難壓嗎? 還是說.22的吸附能力就是比.45強 經濟許可下.22一定會是最首選呢? 謝謝 -- ※ 發信站: 批踢踢實業坊(ptt.cc), 來自: 120.126.50.146 (臺灣) ※ 文章網址: https://www.ptt.cc/bbs/Biotech/M.1627193134.A.3D5.html ※ 編輯: steve42125 (120.126.50.146 臺灣), 07/25/2021 14:08:12
推
07/25 16:48, 3年前 , 1F
大的蛋白質應不至於transfer 不過去
07/25 16:48, 1F
謝謝您的回覆，我後來想想自己問的問題好像有點白痴 如果真這樣過不去，大家平常.22過無菌應該一堆東西就都不見了XD 但還是想問問大家實際上的經驗 ※ 編輯: steve42125 (120.126.50.146 臺灣), 07/25/2021 16:56:42
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07/26 09:07, 3年前 , 2F
如果你知道PVDF是怎麼黏蛋白質的，就不會覺得會「卡不
07/26 09:07, 2F
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07/26 09:07, 3年前 , 3F
進洞裡」了。
07/26 09:07, 3F
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07/26 09:14, 3年前 , 4F
我家一直用 .45 的PVDF，一張上面同時要看1x kDa 和～
07/26 09:14, 4F
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07/26 09:14, 3年前 , 5F
200 kDa 是家常便飯，如果你懷疑因為蛋白質太小穿過PV
07/26 09:14, 5F
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07/26 09:14, 3年前 , 6F
DF，可以先試試看transfer時放兩片PVDF，然後比較看看
07/26 09:14, 6F
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07/26 09:14, 3年前 , 7F
兩片PVDF上的染色結果。
07/26 09:14, 7F
我後來也覺得我問這個問題真的是有點愚蠢(汗 兩片PVDF我覺得是一個很好的嘗試 謝謝您的建議，我會試試看！
推
07/26 13:38, 3年前 , 8F
不會； 倒是可能轉漬時間或 bfr等原因 導致130的轉漬
07/26 13:38, 8F
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07/26 13:38, 3年前 , 9F
效果不好
07/26 13:38, 9F
看起來得多試試幾個條件 ※ 編輯: steve42125 (120.126.50.146 臺灣), 07/26/2021 15:04:17
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07/26 22:20, 3年前 , 10F
我自己有測試過，transfer buffer的配方影響非常大，
07/26 22:20, 10F
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07/26 22:24, 3年前 , 11F
有沒有加SDS、SDS的濃度、用的是 Towbin、2x Towbin 還
07/26 22:24, 11F
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07/26 22:24, 3年前 , 12F
是 Bjerrum Schafer-Nielsen Buffer？反而methanol濃度
07/26 22:24, 12F
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07/26 22:25, 3年前 , 13F
10% 和 20% 沒什麼影響，那次測完才知道我原本用的系統
07/26 22:25, 13F
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07/26 22:25, 3年前 , 14F
over transfer 非常嚴重，可能有10%~25%的蛋白質都穿過
07/26 22:25, 14F
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07/26 22:26, 3年前 , 15F
去了.....
07/26 22:26, 15F
沒想過調condition真不知道裡頭大哉問 好好來研究研究.....
推
07/27 13:23, 3年前 , 16F
其實15kda用.45可以啦 不要轉太久就好 我以前常做
07/27 13:23, 16F
好的，感謝建議！ ※ 編輯: steve42125 (120.126.50.146 臺灣), 07/27/2021 13:51:25
推
07/27 19:49, 3年前 , 17F
順便借問一下 一樣差不多130的膜蛋白有什麼好用的tran
07/27 19:49, 17F
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07/27 19:49, 3年前 , 18F
sfer buffer condition嗎？
07/27 19:49, 18F
我們原本是用5.8g Tris+2.9g glycine+5ml 10% SDS+800ml 水 然後調pH到9.2再補200ml methanol 400mA transfer 1小時 溼式的 僅供參考XD ※ 編輯: steve42125 (120.126.50.146 臺灣), 07/28/2021 08:17:18
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07/28 19:46, 3年前 , 19F
為什麼要調pH？
07/28 19:46, 19F
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07/28 19:48, 3年前 , 20F
如果％偏高的話,400mA/1h應該會有些high MW還在膠上
07/28 19:48, 20F
推
07/28 19:50, 3年前 , 21F
調pH不會降低緩衝能力嗎？
07/28 19:50, 21F
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07/28 21:41, 3年前 , 22F
你的 transfer 是半乾還是濕式？如果是濕式，你的 TB
07/28 21:41, 22F
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07/28 21:42, 3年前 , 23F
配方看起來是 Bjerrum Schafer-Nielsen Buffer + 0.05%
07/28 21:42, 23F
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07/28 21:43, 3年前 , 24F
SDS，我直接告訴你，這個就是我說的「原本用的會有大量
07/28 21:43, 24F
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07/28 21:43, 3年前 , 25F
蛋白直穿過去的系統」
07/28 21:43, 25F
推
07/29 07:22, 3年前 , 26F
小protein transfer 建議不要加SDS 容易過頭
07/29 07:22, 26F
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07/31 20:16, 3年前 , 27F
不是有marker嗎?
07/31 20:16, 27F
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07/31 20:20, 3年前 , 28F
我們家289kDa跟8kDa的都用一樣的buffer跟膜
07/31 20:20, 28F
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