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Western Blot有結果，SDS-page卻沒有

看板Biotech (生命科學)作者 (opport)時間3年前 (2021/05/25 16:59), 3年前編輯推噓3(3推 0噓 29→)
留言32則, 7人參與, 最新討論串1/1
這是我的western https://i.imgur.com/TVfCx4Y.jpg
這張是page https://i.imgur.com/v6o9BWj.jpg
Western 有在目標大小上（16KDA左右），但page沒有 而且還有其他的band 樣本：0.5mM IPTG誘導純化後的elute 五管+1mM IPTG五管（結果比較明顯看到是兩個wel l而已） 煮蛋白時間：95度 五分鐘 跑電泳時間：150V 300A 75分 轉漬：300V 400A 150分 由於實驗室的機器好像是只能拿來跑DNA的 所以電流或是電壓會有點不穩 因實驗室還未購置新機器 所以只能勉強用 Comassie blue室溫染overnight 退染在烘箱65度 overnight 以上步驟都是按照先前實驗室學長姐留下來的 且在做誘導前就有先直接煮蛋白（未破菌） 以下這張圖在跑電泳的時候有去動到或是配buffer有錯（有點忘記什麼原因）所以有點醜 WB附圖 https://i.imgur.com/xnoD002.jpg
會是什麼原因導致western blot有，但page沒結果 -- ※ 發信站: 批踢踢實業坊(ptt.cc), 來自: 114.137.158.128 (臺灣) ※ 文章網址: https://www.ptt.cc/bbs/Biotech/M.1621933152.A.172.html ※ 編輯: nm768417 (114.137.158.128 臺灣), 05/25/2021 17:01:46
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05/25 17:26, 3年前 , 1F
染SDSPAGE的染法可以換用銀染 也許單純濃度不夠
05/25 17:26, 1F
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05/25 17:46, 3年前 , 2F
有去做braford assay濃度有200多ug 這樣算高嗎
05/25 17:46, 2F
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05/25 18:00, 3年前 , 3F
如果蛋白質濃度爆高確染不出來 那可能先看看染劑有無配錯
05/25 18:00, 3F
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05/25 21:47, 3年前 , 4F
了解 實驗室的染劑是從之前就一直用到現在 搞不好會有一
05/25 21:47, 4F
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05/25 21:47, 3年前 , 5F
些問題也是有可能
05/25 21:47, 5F
推
05/26 03:47, 3年前 , 6F
coomassie sensitivity本來就低 然後你的protocol滿奇
05/26 03:47, 6F
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05/26 03:47, 3年前 , 7F
妙的
05/26 03:47, 7F
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05/26 10:54, 3年前 , 8F
電源供應器就只是個電源供應器，不會特地去分跑DNA跑蛋
05/26 10:54, 8F
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05/26 10:55, 3年前 , 9F
白質的，然後應該是 150V，300mA吧？而且實際上跑的時
05/26 10:55, 9F
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05/26 10:57, 3年前 , 10F
候應該是跑不到300mA的，Transfer適用半乾嗎？300V很高
05/26 10:57, 10F
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05/26 10:57, 3年前 , 11F
耶？
05/26 10:57, 11F
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05/26 10:59, 3年前 , 12F
第一張圖比較有可能是PAGE的問題，因為連 Marker都跑得
05/26 10:59, 12F
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05/26 10:59, 3年前 , 13F
很糟；第二張圖應該是染劑壞了，因為連Marker都染不太
05/26 10:59, 13F
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05/26 11:00, 3年前 , 14F
到；第三張圖比較可能是Sample的問題，因為Marker跑得
05/26 11:00, 14F
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05/26 11:01, 3年前 , 15F
不錯，我會覺得是overloading。然後你的marker真神奇，
05/26 11:01, 15F
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05/26 11:01, 3年前 , 16F
竟然會在WB跟sample一起呈色？
05/26 11:01, 16F
推
05/26 11:44, 3年前 , 17F
有些 marker真的會 XD
05/26 11:44, 17F
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05/26 12:04, 3年前 , 18F
是300mA
05/26 12:04, 18F
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05/26 12:07, 3年前 , 19F
第三張圖是WB 抱歉沒有說明清楚（已更新
05/26 12:07, 19F
※ 編輯: nm768417 (114.137.158.128 臺灣), 05/26/2021 12:07:38
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05/26 12:08, 3年前 , 20F
用的是溼式
05/26 12:08, 20F
推
05/26 14:51, 3年前 , 21F
純化不好，有雜bands正常。
05/26 14:51, 21F
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05/26 14:51, 3年前 , 22F
誘導前直接煮蛋白是什麼意思？
05/26 14:51, 22F
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05/26 15:00, 3年前 , 23F
每個well你下多少的量？
05/26 15:00, 23F
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05/26 17:59, 3年前 , 24F
誘導前煮蛋白意思是說，我有試過沒有破菌直接煮跟破菌
05/26 17:59, 24F
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05/26 17:59, 3年前 , 25F
後跑純化的
05/26 17:59, 25F
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05/26 17:59, 3年前 , 26F
每個well下20 ul
05/26 17:59, 26F
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05/27 07:07, 3年前 , 27F
我們家普通染色會加 BSA至少一個 well當對照
05/27 07:07, 27F
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05/27 07:07, 3年前 , 28F
所以你每個well至少 4ug，但你目標蛋白可能還不到 100ng，
05/27 07:07, 28F
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05/27 07:07, 3年前 , 29F
所以看不出來
05/27 07:07, 29F
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05/27 07:13, 3年前 , 30F
marker的量可以當粗略的參考來比對
05/27 07:13, 30F
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06/11 23:43, , 31F
CBB跟WB敏感度差非常多 以前純化完蛋白CBB看到一條band，
06/11 23:43, 31F
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06/11 23:43, , 32F
把他稀釋50倍跑WB，整個band是炸開的。
06/11 23:43, 32F
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