[討論] 定序後找不到cutting site序列
各位早，想與各位討論一個cloning後奇怪的情況。
1. 目的是從A plasmid 把 A insert 以XhoI/XbaI切下來，置換B insert。
A plasmid的 sequence 不清楚 （沒有map)，只知道經由雙切、gel extraction後約為6k
。
B insert sequence是知道的，以PCR amplification。頭尾設計有cutting site sequenc
e，PCR product同樣以gel extraction回收，雙切後再回收一次，約3.2k。
回收後的vector與insert進行Ligation，並有挑到一個候選的colony。
2. Clone後的plasmid以下述方法確認：
2.1 以XhoI/XbaI雙切確認，確實可以得到3.2k 與 6 k的sequence。
2.2 以BamHI單切可以得到得到300多bp 的band (insert中本來就帶有兩個BamHI的切位，
且確實會掉出300bp片段)。
2.3 以PCR夾確實也可以得到3.2k的band。
因此我就把這個Clone送定序了。
3. 定序時有以B insert序列合成5條Primer，分別如下：
Primer 1: 500 bp 處往回夾
primer 2: 400 bp 往後夾
primer 3: 1100 bp 往後夾
Primer 4: 1800 bp 往後夾
Primer 5: 2500 bp 往後夾
但是定序結果出現了奇怪的問題，也是相與各位討論的點。
比對結果發現
1.insert的序列完全沒錯。
2.但是insert 前後，vector的序列都不是XhoI/XbaI的序列。
那為何雙切確認時還切得出來。
這個plasmid有可能發生什麼事情嗎，或有可能是定序的問題。
請各位提供意見與看法，謝謝。
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