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[討論] Full-length cDNA cloning

看板Biotech (生命科學)作者 ( )時間2年前 (2022/02/10 23:02), 2年前編輯推噓2(2推 0噓 50→)
留言52則, 5人參與, 2年前最新討論串1/1
一般要clone一個基因的全長序列， 就設計能涵蓋cds的primer去放大目標基因的cDNA 不過如何認定哪一條才是全長越來越難判斷，特別是人的基因 不知道做cDNA cloning時有沒有選擇isoform明確的依據或共識， 像是cds最長？exon最多？或是表現最高？ 有想過只要跟發表過的lab索取就可以引用該paper來背書 但這樣好像怪怪的，不是真的解決問題 舉我遇到的基因為例，先簡化只看表現量最多的前兩個isoform E2F3: cds較長的isoform(多131aa)，表現略低2倍 OAS2: cds較長的isoform(多32aa)，表現略高4倍，但exon/intron少一個 CD86: 兩個isoform(差異6aa)，表現量不分軒輊 稍複雜一點的有FOXM1 isoform A序列最長，最多coding exon，但表現只佔全部1/40 缺一個exon的isoform C表現量佔19/40，缺兩個exon的isoform B佔20/40 更複雜的有遇到TCF7L2，宛如有polymorphic transcripts 當初cDNA cloning時就覺得它好像沒有明顯的isoform 原本還想過是不是需要人造的方式拼出可能不存在的全長 -- ※ 發信站: 批踢踢實業坊(ptt.cc), 來自: 180.218.151.4 (臺灣) ※ 文章網址: https://www.ptt.cc/bbs/Biotech/M.1644505366.A.BC2.html
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這是一個很重要，但10年後才有正確資料依循的問題，目前各
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大資料庫有的是以 “最常被文獻用到的 exon" or "所有的CD
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S exon+最長的utr exon" 連接, 或者兩者混合. 定義為 sel
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ect or canonical transcript.
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02/11 15:14, 2年前 , 5F
基本上，會越來越趨向用 2nd or 3rd NGS 的定序資料來定義
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探討transcript是更深入的層次，我想問的沒那麼重要啦 而且不同transcript往往差在前後UTR 只要保有相同的cds就無礙於平常的cDNA cloning 但是當透過transfect外表現一個基因來探討有/無改變什麼現象時 使用的cds差異或許wild type/full lengt會變成mutantion/truncation了
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02/11 18:57, 2年前 , 6F
我覺得考慮哪一個是「全長」是沒有意義的，重點應該在
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於你的研究是什麼？假如你想探討的是一個基因在特定的
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時期(發育或成年)特定組織中的功能，那你只要拿該組織
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樣本的 cDNA 做 cloning，得到的 isoform 就是你要的「
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全長」了，如果這個基因已經有很多已知 isoform，就在
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paper 中寫明 clone 到的是哪一個 isoform 就好了，如
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果樣本中同時有 2 種甚至以上的 isoform 被表現，就要
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看是否有某一種 isoform 占大多數，甚至可以把有表現
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的都 clone 下來做分析，還可以探討 isoform 是否分別
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具有不同的功能
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是呀，目前是都先紀錄是哪個NCBI accession number 主要是看到作者會在M&M提到"全長"的clone，尤其跟自己的長不一樣時 總會猜想是不是有什麼常用的判別方式 至於探討各別isoform就偏離方向了，還是留給有興趣的人做 喔對了，要挑哪個isoform也可能在設計primer的階段就決定了 運氣不好的話得換過幾組primer才能成功
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細胞株、實驗條件不同，得到的clone有時候就不一樣。我們的
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經驗是看到不一樣就從splice site看合不合理，沒問題就不同
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clones都拿下去做驗證。
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早期會用Northern blot看可能的isoforms及表現量做決定
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02/12 09:11, 2年前 , 20F
現在是看大家拿哪個就做哪個，除非有其他考量。
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以前的確會這樣，透過site-direct修改成paper用到的isoform
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isoforms這種東西真的很看運氣，要探討的基因倒霉的話就有
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成千上萬個isoforms，又或是readthrough transcripts。
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大概再五年，就能便宜的進行第三代 FL-cDNA/RNA 定序. Clo
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ning之前先把 target gene有哪些 expressed isoforms, 且
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這些 isoforms 個別的表現高低都能知道，屆時再合成出對應
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量的 FL isoform clones 進行實驗. BTW, Tp53 是一個同時
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是指每次用isoforms pool取代單一clone做transfection嗎？ 這不太可能吧，相對量無法輕易的透過表現數個clone還原出來 不過若用表現量最高這個原則，我也比較偏好如此 目前我的做法是從GTEx找出表現量最高transcript後去cloning 因此難免遇到跟NCBI認定最長的FL isoform有差異 後來也出現了與paper上提到的序列不一致的問題 這就是最大的顧慮
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間有許多 isoforms 進行蛋白質表達的基因, 現在很多的 RNA
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研究都忽略這個重要因素.
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※ 編輯: blence (118.233.138.244 臺灣), 02/12/2022 18:20:25
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02/12 19:56, 2年前 , 29F
通常要 clone 一個基因時，我設計 primer 會以 NCBI
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ref-seq 中編號最小，或位數最少的 NP sequence 為準，
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02/12 19:58, 2年前 , 31F
另外，與其用 isoform pool，我到寧願用 piggybac 直接
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送 gene locus 進去讓細胞自己決定要表現哪些 isoform
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#送用constitutive promoter 或 inducible promoter
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drive 的基因 locus
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推
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“NCBI認定最長的FL“ 沒有考慮到組織/細胞表現特異性，原
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Po用GTEx會比Refeq select isoform更合理
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02/14 00:27, 2年前 , 37F
沒錯,若參考的NCBI序列沒P出來,不一定是技術問題
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就像上面說的情況,這時換掉primer或換細胞就好了
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推
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試試看 CRISPR activation？(dCas9-SAM)
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02/18 12:16, 2年前 , 40F
CRISPR activation 啟動了內生性基因，但 target isoform
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02/18 12:16, 2年前 , 41F
是否能產生是個問號，直接塞一個剪好的較直接
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02/18 14:22, 2年前 , 42F
CRISPRa/i也是要cloning,該面對的isoform還是避不掉
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02/18 14:26, 2年前 , 43F
況且cDNA cloning增加表現只是功能之一,另有更多實驗目的
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02/18 14:49, 2年前 , 44F
micha版友的意思應該是不使用 vector 表現，而改用
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02/18 14:50, 2年前 , 45F
CRISPR activation 去起動基因表現，由組基或細胞自己
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02/18 14:51, 2年前 , 46F
本身擁有的機制決定要表現哪些 isoform。不過這樣只能
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02/18 14:51, 2年前 , 47F
解決 alternative exon 的 isoform，遇到 alternative
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02/18 14:52, 2年前 , 48F
TSS 的 isoform 也是不知道要啟動哪一個就是了
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02/18 14:52, 2年前 , 49F
啟動 組織
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02/18 14:53, 2年前 , 50F
不過這方法也怪怪的，樣本細胞本身就不表現這個基因，
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02/18 14:55, 2年前 , 51F
做出來的 isoform 到底具有什麼意義實在很難回答
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02/18 17:52, 2年前 , 52F
這倒是一個有趣的issue, 感覺會出現很多種可能
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