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[求救] colony PCR p不出insert

看板Biotech (生命科學)作者 (芸)時間2年前 (2022/09/07 18:22), 編輯推噓5(5推 0噓 30→)
留言35則, 11人參與, 2年前最新討論串1/1
各位版友好，第一次發文，如果有什麼格式不合還煩請提醒，謝謝大家 我的plasmid是以Gibson Assembly 組合insert 跟 pUC 的vector，之前藍白篩有成功轉入E. coli XL1-blue，從其中抽plasmid出來，想再轉入 E. coli DH5A 跟BL21(DE3)分別做保存跟表達，以colony PCR快速篩選Transformation 菌盤上的菌卻一直無法得到目標基因。 colony PCR有以之前抽取所得plasmid另外做一個正控制組，有得到目標基因。 transformation的實驗流程如下：將competent cell置於冰上解凍，注入5% plasmid DNA後，震盪一秒、放在冰上5分鐘，再以42°C heat shock 30sec，塗到LB/Amp plate上養overnight。 （以上流程都是參考自competent cell廠商提供的protocol) transformation時也有塗沒有plasmid的組別做為負控制組，也如預期沒有長菌落 目前個人覺得會是colony中的plasmid 沒有insert，之後會想同一colony 以目標基因的primer跟AmpR的primer去跑colony PCR驗證 不知道版友們有沒有什麼其他的建議？謝謝大家 -- Sent from nPTT on my iPhone 12 mini -- ※ 發信站: 批踢踢實業坊(ptt.cc), 來自: 223.137.201.154 (臺灣) ※ 文章網址: https://www.ptt.cc/bbs/Biotech/M.1662546128.A.9BE.html
推
09/07 20:07, 2年前 , 1F
重做
09/07 20:07, 1F
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09/07 21:09, 2年前 , 2F
PCR 有positive control and negative control? 如何判
09/07 21:09, 2F
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09/07 21:09, 2年前 , 3F
斷沒有insert？ 另外看敘述應該是plasmid transformatio
09/07 21:09, 3F
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09/07 21:09, 2年前 , 4F
n. 有沒有考慮直接抽plasmid (DH5a)做RE check?
09/07 21:09, 4F
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09/07 21:23, 2年前 , 5F
為了保存或表達的re-transform會需要用colony-PCR來驗證真
09/07 21:23, 5F
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09/07 21:24, 2年前 , 6F
偽,那代表在XL1-blue階段做的colony-PCR就是錯的
09/07 21:24, 6F
推
09/07 21:34, 2年前 , 7F
我自己做的話, 會在藍白篩完再挑菌做colony pcr或者抽p
09/07 21:34, 7F
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09/07 21:34, 2年前 , 8F
lasmid digestion擇一, 有對的話再送一到兩個plasmid去
09/07 21:34, 8F
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09/07 21:34, 2年前 , 9F
送定序確認, 定序對了之後re-transform照理說全部都會
09/07 21:34, 9F
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09/07 21:34, 2年前 , 10F
是你要的plasmid不太會有別的, 就不太會特別去check了
09/07 21:34, 10F
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09/07 22:03, 2年前 , 11F
後來發現colony PCR NEB有專門的kit，我的colony PCR
09/07 22:03, 11F
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09/07 22:03, 2年前 , 12F
指的是直接勾菌落跟NEB Q5 High Fidelity DNA Polymer
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09/07 22:03, 2年前 , 13F
ase 去跑PCR
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09/07 22:03, 2年前 , 14F
可能會試試RE去digest 從藍白篩那邊抽出來的plasmid
09/07 22:03, 14F
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09/07 22:03, 2年前 , 15F
是不是我預期的長度，謝謝樓上各位大神的指教了
09/07 22:03, 15F
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09/07 22:31, 2年前 , 16F
用 Q5 HF 做 colony PCR.....好闊的實驗室啊！
09/07 22:31, 16F
推
09/08 03:47, 2年前 , 17F
q5極挑template neb的onetaq就便宜大碗 colony pcr常
09/08 03:47, 17F
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09/08 03:47, 2年前 , 18F
批不出來的原因是菌下太多 我會先在另一個plate上面
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09/08 03:47, 2年前 , 19F
捅一下把太多的菌抹掉再進mix
09/08 03:47, 19F
推
09/08 03:49, 2年前 , 20F
如果一定要用hf taq做colony pcr 我建議phusion或是一
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09/08 03:49, 2年前 , 21F
個新東西叫repliqa toughmix 然後一開始要記得熱3分
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09/08 03:49, 2年前 , 22F
鐘破菌
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09/08 10:47, 2年前 , 23F
我也是投拿你之前抽的去切 RE 一票，然後想問問：你具
09/08 10:47, 23F
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09/08 10:48, 2年前 , 24F
體來說是拿了幾 ng 的 plasmid DNA 去 transform？長出
09/08 10:48, 24F
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09/08 10:48, 2年前 , 25F
的 colony 大概有多少？
09/08 10:48, 25F
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09/08 13:19, 2年前 , 26F
從藍白篩抽出來的開始確認吧，感覺那邊就錯了
09/08 13:19, 26F
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09/08 21:08, 2年前 , 27F
我是取795.85 ng的DNA去transformation，長出來的菌落
09/08 21:08, 27F
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09/08 21:09, 2年前 , 28F
約900多顆
09/08 21:09, 28F
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09/08 22:51, 2年前 , 29F
你的transform菌液是全部拿去塗盤還是只取部分？我如
09/08 22:51, 29F
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09/08 22:51, 2年前 , 30F
果拿純化的plasmid用你說的那個量做transform，菌會直
09/08 22:51, 30F
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09/08 22:51, 2年前 , 31F
接長成一片膜蓋滿整個盤子完全沒辦法算，只有長900多
09/08 22:51, 31F
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09/08 22:51, 2年前 , 32F
顆我覺得太少了，應該是有問題
09/08 22:51, 32F
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09/09 11:11, 2年前 , 33F
Insert 多大？怎麼來的？
09/09 11:11, 33F
推
10/03 22:40, 2年前 , 34F
colony PCR很吃挑菌的手感，建議養液體過夜再取1ul進
10/03 22:40, 34F
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10/03 22:40, 2年前 , 35F
行PCR
10/03 22:40, 35F
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