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[求救] 腫瘤冷光訊號消失

看板Biotech (生命科學)作者 (yuang)時間1年前 (2023/09/24 00:43), 編輯推噓0(0推 0噓 32→)
留言32則, 4人參與, 1年前最新討論串1/1
（手機排版傷眼很抱歉） 各位前輩們晚上好 小弟欲分析材料的抗癌效果,因此轉染了冷光基因到癌細胞並打入小鼠體內,結果訊號大概 在第三週消失了QvQ不知道哪個環節出問題希望大家救救我！ 以下提供作法 Plasmid: pGL4.1-Luc2(Neo) Transfection reagent: Lipofectamine 3000 Cell line :K7M2 (mouse osteosarcoma) Step1. 3*10^4 cells/well in 24 well plate Step2. 依據protocol, 500ng DNA per well, reagent跟plasmid用Opti-MEM混合均勻後 加回到細胞轉染24hr Step3. G418(500ug/ml)篩選,大概在第三天後細胞有明顯飄起來，然後剩下貼附的細胞一 團團聚在一起。就更換成沒有G418的medium放大。 細胞繼代過程中有取少量細胞做luciferase assay, 訊號約10^6,所以就很放心的繼續培 養準備動物實驗。 In vivo model: Orthotopic mouse osteosarcoma (intratibial injection) 一隻老鼠3*10^5 Luciferin(3mg) , ip, 10min後上機拍攝 （細胞有先照過ivis,10min的訊號是最高峰） 癌細胞打入體內後1-2週的訊號很明顯，但第三週開始就有小鼠的冷光訊號消失,但鼠鼠們 的腿明顯腫起來,也就是說冷光酵素不再表現了嗎? 請問各位前輩們我整個轉染到動物實驗的環節有哪一部分是做錯的或是要再重新調整的嗎 ？ 我這個plasmid應該是屬於Stable transfection對嗎？ 以及stable transfection後 細胞一定會永遠表現嵌入的基因嗎？ 這個作法我目前有用在另外兩株細胞 1. U87-MG (human glioblastoma) 2. B16F10 (mouse melanoma) U87在裸鼠腦袋中訊號就很穩定的表現,不過黑色素瘤我打在背部結果跟K7M2也有同樣的狀 況發生。 實驗室以醫材為研究方向,老師對這個完全不了解,實驗室也只有我一個博班生QvQ實在是 求助無門,希望大家發現到問題能用力的鞭打我～～ 在此先非常謝謝各位的幫忙（跪） -- ※ 發信站: 批踢踢實業坊(ptt.cc), 來自: 180.177.3.186 (臺灣) ※ 文章網址: https://www.ptt.cc/bbs/Biotech/M.1695487438.A.A98.html
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09/24 01:45, 1年前 , 1F
我這個plasmid應該是屬於Stable transfection對嗎？
09/24 01:45, 1F
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09/24 01:46, 1年前 , 2F
↑不對，這種transfection用的vector你沒有linearize，
09/24 01:46, 2F
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09/24 01:47, 1年前 , 3F
放到細胞基本上都是transient transfection，只有極少
09/24 01:47, 3F
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09/24 01:48, 1年前 , 4F
數會因低機率嵌入genome而變成stable，你應該先挑到
09/24 01:48, 4F
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09/24 01:48, 1年前 , 5F
stable clone 再用它打老鼠
09/24 01:48, 5F
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09/24 01:52, 1年前 , 6F
stable transfection後細胞一定會永遠表現嵌入的基因
09/24 01:52, 6F
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09/24 01:53, 1年前 , 7F
↑不一定，還是有機會被epigenetic regulation 關掉，
09/24 01:53, 7F
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09/24 01:54, 1年前 , 8F
看你的 Luc 用哪個 promoter 表現，pGL4.1-Luc2(Neo)
09/24 01:54, 8F
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09/24 01:55, 1年前 , 9F
本身的 Luc 應該沒有 promoter 才對吧？你們插了什麼進
09/24 01:55, 9F
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09/24 01:55, 1年前 , 10F
去表現它？
09/24 01:55, 10F
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09/24 02:20, 1年前 , 11F
您好，這個plasmid是直接買現成並委託放大的，我看了一下
09/24 02:20, 11F
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09/24 02:20, 1年前 , 12F
產品說promoter有SV40,HSV-TK及CMV,不知道是否有回答您的
09/24 02:20, 12F
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09/24 02:20, 1年前 , 13F
問題
09/24 02:20, 13F
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09/24 02:39, 1年前 , 14F
「更正」 我們買的pGL4.51-luc2-Neo含有CMV promoter
09/24 02:39, 14F
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09/24 07:56, 1年前 , 15F
看起來是stable pool不是stable clone，pool是heterogen
09/24 07:56, 15F
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09/24 07:56, 1年前 , 16F
eous population ，一群表現量有高有低甚至沒表現的混合
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09/24 07:56, 1年前 , 17F
細胞群，或許生長時間久之後這群pool變成只剩下沒表現的
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09/24 07:56, 1年前 , 18F
細胞，而沒有luc activity
09/24 07:56, 18F
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09/24 07:59, 1年前 , 19F
另外你們selection的時間多久，有確認真的已經是stable
09/24 07:59, 19F
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09/24 07:59, 1年前 , 20F
cell line了嗎？ luc cassette 真的有insert into host
09/24 07:59, 20F
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09/24 07:59, 1年前 , 21F
genome了嗎？
09/24 07:59, 21F
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09/24 08:03, 1年前 , 22F
個人經驗是挑選stable clone而非pool，確認已經建立stab
09/24 08:03, 22F
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09/24 08:03, 1年前 , 23F
le line，然後放大成MCB凍存與使用
09/24 08:03, 23F
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09/24 10:31, 1年前 , 24F
搜尋Imanis Life Sciences,如果你們對於建立stable很陌生
09/24 10:31, 24F
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09/24 10:31, 1年前 , 25F
購買人家建立好Luc, GFP等reporter的細胞可能更有效率
09/24 10:31, 25F
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09/24 10:36, 1年前 , 26F
另外有人也遇到腫瘤變大IVIS消失的情況,懷疑是每次照之前
09/24 10:36, 26F
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09/24 10:39, 1年前 , 27F
給的substrate連續幾週下來被免疫熟悉後消滅掉了
09/24 10:39, 27F
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09/24 13:06, 1年前 , 28F
謝謝大家的指點，看起來我只有stable pool的建立導致整體
09/24 13:06, 28F
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09/24 13:06, 1年前 , 29F
細胞的冷光表現不一致。這部分在抗生素篩選後將團聚的細胞
09/24 13:06, 29F
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09/24 13:06, 1年前 , 30F
打散稀釋到多孔盤中繼續篩選，能夠長出來的就算是stable c
09/24 13:06, 30F
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09/24 13:06, 1年前 , 31F
lone嗎？
09/24 13:06, 31F
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09/24 13:22, 1年前 , 32F
之後會建議老師購買冷光細胞株QvQ 希望他聽得進去
09/24 13:22, 32F
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