[求救] bisulfite Genomic PCR

看板Biotech (生命科學)作者travelmat (草蓆)時間14年前 (2011/12/20 13:00)推噓2(2推 0噓 4→)

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一直卡在這步先簡單講一下我的實驗我外插一段dna片段進入活體geomic 然後從活體中取下該部位組織，並且抽其genomic 之後利用BISULFITE的方式檢測這段我所外插的的這段序列在活體環境中甲基化的情況我現在遇到比較大的問題有3個 1. CONTROL如果做? 意思是，我今天把從組織中抽出來的genomic做bisulfite後我PCR不管有無band都需要一個 + control來做對照，才有辦法分析結果我目前想到的方法是: 利用另一組primer落在我bisulfite primer之外，用其去PCR還未bisulfite之前的 GENOMIC，利用PCR product不會甲基化的特性，在將這段product拿去做bisulfite 最後利用bisulfite的primer進行PCR這段product以做為我的control 不知這方法有無利弊? 2. bisulfite的成功度? 因為我是用非kit的方式下去進行這反應，難免需要考慮到轉換的成功度也就是可能整段只有60%轉變，90%轉變我要如何確定我這次處理後的結果，是足以可信的? 目前想到方法有兩種一就直接定序，理論上含有C只有兩種情況，一是CG site的C有甲基化因此他依然為C 另一種則為非CG site依然還是C，則考慮他是為bisulfite不成功 (沒C上沒甲基化則應當會變為U) 不知這邊邏輯上有無錯誤? 不過因為不可能每次處理都送定序因此就用類似想法，下去做另一種測試直接用舉例假設有一段序列簡短如下 TEST primer CG GGATA <----以非處理過bisulfite的genomic為模板 Genomic GC CCTAT <----尚未處理bisulfite的genimic bisulfite G U UU <----處理bisulfite後的genomic ^ ^^ | |---- 這兩個位置應該會轉成U (因為不被甲基化) | |_____ 這個位置可能變，也可能不變利用類似想法下去看primer有無bind上，來測成功度但缺點就是，只重點在primer末6碼有無bind上也就是只能看這6碼的情況，所以代表性還是有差 (但至少是個簡單的辨別方法) 不知這邏輯上是可行嗎? 或是有無更好的方法? 3. 有無能提供bisulfite的protocol? 過程中都無用到KIT的 (包含clean kit) 因為我們LAB只有我在做其他人實驗跟這方面完全不相關所以無從問起問其他LAB多用zymo的methylation kit 有借來試過，老師覺得效果不好，因此選用傳統非KIT方式做目前自己上網有找了一些，多是其中某步需要KIT(CLEAN KIT) 依老師意思是，最早以前都只用酒精沉澱因此我就研究了一下步驟如去鹽類，沉澱，去亞硫基...等等大至上是有造特定一份protocol,但小處有改這樣但因為這種東西很怕差一點點差很多，尤其protocol混用怕因此影響結果 (如前後比例問題) 所以才來求protocol 以上三個問題，望各為大大救救小弟我我在這邊卡非常非常非常久了在此先感謝各位大大了。 -- ※ 發信站: 批踢踢實業坊(ptt.cc) ◆ From: 140.120.130.105

推

atung1988

12/20 18:40, , 1^F

12/20 18:40, 1^F

就.......... 問過反應是都不錯啦... 老師的考量可能除了效果以外還有價錢吧..... >"< ※ 編輯: travelmat 來自: 140.120.130.105 (12/21 14:14)