Re: western band反白

看板Biology (生物學)作者Ithilloth (Ithilloth)時間20年前 (2005/01/27 04:37)推噓0(0推 0噓 0→)

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high background, 在非抗原的蛋白質容易出現反白的情況簡單的例子就是 protein marker 我跑的膠用prestained protein ladder. 5 ul/well 抗體titer是用說明書上建議的當exposure時間(我用ECL)過長時 marker的部份就會反白非常清楚可以檢討high background的原因 blocking solution, incubation time, antibody titer, exposure time... specificity越低的抗體越容易出現high background 抗體濃度越高時亦然 ※ 引述《KAEDERUKAWA.bbs@bbs.csie.ncu.edu.tw (uranff)》之銘言： : > 這是因為抗體濃度的關係 : > 是不是自己製作的抗體 : > 通常要自己試一下 : > 這樣的結果應該是抗體濃度太高 : > 你可以先做一個實驗 : > 相同的sample用不同稀釋抗體濃度去試 : > 例如 : > 1:10000 : > 1:50000 : > 1:100000 : > 要看你反白的那次抗體濃度用的是多少自己設計 : > 上面我說的是一抗的濃度 : > 你二抗的濃度就固定調成一抗濃度稀釋的五倍 : > 例如一抗 : > 1:10000 : > 那你二抗就調 : > 1:50000 : > 這樣做做看 : > 找出一個適合你protein的抗體濃度 : > 不過如果你抗體濃度稀釋的真的已經很高很高 : > 我建議要下降你的protein濃度 : > ㄧ般用到1ug/ul就可以了 : > 不用太高 : 我自己是用打兔子得來的血清IgG做Western : 抗體濃度大約是1μg/μl，稀釋比例為1：500 : 用這個比例下去做，偶而會有這種band反白的情況 : 可又並非是每次都會這樣 : 另外不知道有用自製抗體做過的先進們有沒有碰過這個問題 : 我將血清以兩次protein G sepharose純化過 : 純化出的IgG與買來的抗體相比差不多純（直接一起跑SDS-PAGE之後染Coomassie blue） : 之後我就一起收在4℃，有加0.05％ sodium azide : 以後就一直拿同一管出來做Western : 可是最近幾天的Western做完之後呈色都沒有訊號 : 但是換了另外一管（一樣收藏在4℃），用一樣的稀釋比例去做就又做的出來 : 然而之後拿這兩管直接去跑SDS-PAGE卻又看不出先前我使用的那一管有degrade現象 : 這讓我覺得很奇怪，到底我的保存方式是不是不對？請大家指教 -- ※ 發信站: 批踢踢實業坊(ptt.cc) ◆ From: 61.62.148.164