Re: [求救] Medium跑western

看板Biology (生物學)作者vixen (2tp27t)時間18年前 (2008/03/13 17:49)推噓1(1推 0噓 6→)

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※ 引述《latte366 ( )》之銘言： : 標題: Re: [求救] Medium跑western : 時間: Thu Mar 13 04:40:48 2008 : ※ [本文轉錄自 Biotech 看板] : : : ※ 引述《boblu.bbs@beta.life.nthu.edu.tw (六百)》之銘言： : : : ※ 引述《ballycotton7.bbs@ptt.cc (昂布拉股)》之銘言： : : : > 最近要看一些外送到Medium中的protein : : : > 所以將medium拿去跑western : : : > 但是總是偶而會有band 較多時候有時候都沒有訊號而且片子的background都髒髒的 : : : > 我的方法是先將約100ul的Medium加入loading dye之後下去煮過 : : : > 將體積煮至40~50之後 loading : : : > 但是有時候煮過會發現底部有一些藍色的沉澱物 : : : > 但是我還是全部loading下去 : : : : 這種煮到乾的做法有文獻可考嗎？ : : : 感覺有點可怕 : : : 而且我直覺認為鹽類濃度的改變會對結果造成一些難以預期的影響 : : : 如果是我我會用 centricon 之類的東西來濃縮啦... : : : 或者是作 IP or IP-western : ^^^^^^^^^^^^^^^^^這是指用免疫沈澱法取出我要的protein : 然後再跑western嗎？ : 不曉得有沒有誤解您的意思我想IP-western就是這個意思, 但是這是一種選擇性的純化, 有時後會屏蔽掉你想看到的結果. 您要看medium當中的甚麼呢? : : 我想問你的是...你的medium裡有沒有serum.. : : 聚我所知..serum影響很大 : : 跑出來會有黑色ㄧ團 : : 我後來是用serum free... : : 取2-3ml的medium濃縮至50-70 ul後加 loading dye煮 : : 然後用well比較大的去跑 : : 我是上層膠配比較長(也就是下層膠要比較短) : : 然後讓他跑一下下之後再把沒loading完的load完 : : 借個標題 : 我也是用濃縮的方式來濃縮我的medium (DMEM/F12;含2％serum) : 方法是以抽真空的方式將體積濃縮 : 整個chamber的溫度大概10度C左右也就是我裝sample的離心管也是10度C : 總體積8ml-->200~500ul 約需6～8小時 : : 我的問題是： : : 1. 像這樣沒有加protease、phosphorease inhibitor有沒有關係呢？ : 雖然我不是要看phosphoration 但還是會擔心degrade的問題老話一句, 看你要看medium當中的甚麼而定, 沒有標準答案. 以前我同僚跑medium的western是找病毒/liposome, 加不加protease inhibitor沒差. 如果你是要看某個蛋白, 一收穫就先加一下PMSF, 加到1mM試試看. 雖然PMSF(請用無水酒精配置,不要用95%酒精)在水溶液中只能撐半小時, 但是PMSF的inhibition是永久性的, 這樣有沒有比較心安? : 2. 如果要加各位會選擇在濃縮之前加還是濃縮之後再加 : 前者我擔心會有鹽類過高問題而且需要加的量要很多（一管8ml 有12管） : 後者我擔心在濃縮過程就有degrade了濃縮後再加會不會就失去時效性 : : 補充： : 我跟同學討論有想說是不是先加個不是鹽類的inhibitor : 如： PMSF頂一下不過各位也知道 PMSF的半衰期約30min~60min : Aprotinin、Leupeptinin、Pepstatin 我不曉得是否很貴 : 如果很貴大概也不能讓我拿來這樣揮霍等濃縮完了再加Aprotinin、Leupeptinin、Pepstatin可以較省, 不過我不知道你到底要看啥東西, 有些蛋白不太怕protease,有些目標則因含量關係而不是很必須加protease inhibitors, 看你目標而定. : 而其它如 NaCl、Na3VO4、NaF都會影響鹽的濃度 : tris-base、 Na-deoxycholate會不會我不清楚( tris應該也會吧?!） : : 爬前文有人說Aprotinin、Leupeptinin、Pepstatin、PMSF加多沒關係 : 所以我才把濃縮產生的問題專注在其它鹽類 : 雖然我也不確定是不是就真的上述四者不會影響 : 我知道millipore有賣 centricon Ampicon這種透析的管子 : 不過真的太貴了....orz 不知道你要看啥我很難回答, 不過看你這麼在意protease, 可能是要看蛋白. 你試過AS(ammonium sulfate)或TCA precipitation嗎? 那就不用為鹽煩惱了如果能夠, 盡量用serum free medium, 真的不行, 你得看一下 AS/TCA在濃度多少時會把serum沉下來, 多少時會把你的目標沉下來. 常見的AS/TCA precipitation的步驟在各實驗本或google都可找到. -- .*#*. .*#*. .*#*. .*#*. .*#*. .*#*. | | | * * | | | * | | | * * | | | * | | | * * | | | * | | | * * | | | * * | | | * * | | | * * | | | * * | | | * * | | | * | | | * * | | | * | | | * * | | | * | | | * `*#*' `*#*' `*#*' `*#*' `*#*' `*#*' -- ※ 發信站: 批踢踢實業坊(ptt.cc) ◆ From: 24.8.145.70