[問題] western作不出來!!快救救我呀...

看板Biology (生物學)作者 (pinrupony)時間13年前 (2012/04/27 22:56), 編輯推噓6(6011)
留言17則, 9人參與, 最新討論串1/1
【問題】:B-actin都難壓出來,壓出來超白的!! 蛋白質濃度是40 ug,蛋白質+sample loading dye加熱5分鐘, 跑膠的時間約45分鐘,室溫下, 轉漬時間2小時,200 mA, 1抗壓1小時,PBST洗15分鐘,2抗壓1小時,PBST洗20分鐘 然後用冷光儀壓片30秒一張,B-actin很淡不然就是沒有... 請大家幫我解決這個問題... -- ※ 發信站: 批踢踢實業坊(ptt.cc) ◆ From: 123.205.139.35

04/27 22:59, , 1F
用的抗體是santa cruz,比例是1:1000
04/27 22:59, 1F

04/27 23:00, , 2F
2抗是invitrogen,比例是1:2000
04/27 23:00, 2F

04/27 23:08, , 3F
只有ACTIN有問題?
04/27 23:08, 3F

04/27 23:27, , 4F
可能蛋白質太多,ECL反應光了。冷光儀選擇5秒或更少照照看
04/27 23:27, 4F

04/27 23:30, , 5F
看你推文,抗體用得太濃可能也是問題,b-actin好的一抗可以用
04/27 23:30, 5F

04/27 23:34, , 6F
到1:10000,通常WB好的二抗1:5000以上不是問題。
04/27 23:34, 6F

04/28 01:44, , 7F
沒有..其他target也有這樣的問題..就有的時候壓得出來
04/28 01:44, 7F

04/28 01:45, , 8F
有的時候就是壓不出來...謝謝J大,我會試試看的!!
04/28 01:45, 8F

04/28 11:14, , 9F
sample保存太久?
04/28 11:14, 9F

04/28 12:06, , 10F
sample是4/11收的,快半個月吧
04/28 12:06, 10F

04/29 13:16, , 11F
沒圖沒真相, 轉漬後blocking前ponceau S染的膜來一張看看
04/29 13:16, 11F

04/29 13:19, , 12F
冷光儀是啥? CCD嗎? 那鏡頭的光圈是否可調大?另外一抗可過夜
04/29 13:19, 12F

04/29 23:00, , 13F
一抗overnight比較美.. 以前同樣條件就壓不出來嗎
04/29 23:00, 13F

05/13 10:45, , 14F
santa cruz的抗體很爛 換millipore的吧
05/13 10:45, 14F

05/17 15:39, , 15F
跟別的實驗室借少量抗體做一次看看吧
05/17 15:39, 15F

05/26 23:25, , 16F
一抗建議overnight, 並且不要使用milk作為一抗的buffer
05/26 23:25, 16F

05/26 23:26, , 17F
二抗請問是mouse monopolyclone的嗎?
05/26 23:26, 17F
文章代碼(AID): #1FchEqxu (Biology)
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