Re: 請問各位有沒有好用的抽nuclear extract的土法呢?
Solution A ( 20mM Hepes pH7.5, 5mM KCl, 0.5mM MgCl2, 0.5mM DTT,
0.2mM sucrose )
Solution B ( 20mM Hepes pH7.5, 5mM KCl, 0.5mM MgCl2, 0.5mM DTT,
1mM PMSF )
Solution C ( 20mM Hepes pH7.5, 0.5mM MgCl2, 0.5mM DTT, 1mM PMSF
0.25mM sucrose )
Solution D ( 20mM Hepes pH7.5, 0.5mM MgCl2, 0.5mM DTT, 1mM PMSF
0.6mM sucrose )
Solution E ( 50mM Hepes pH7.5, 10% sucrose )
細胞超過108 將其消化以PBS清洗細胞，離心1000 rpm 5min
-->去上清液
加入15ml sol.A 懸浮細胞，離心1000 rpm 5min, 共三次
-->去上清液
細胞懸浮於4ml sol. B中，置於冰上10min，用pestle B 反覆研磨，置於顯微鏡下觀察，
直到視野中為細胞核，離心1000 rpm 5min
->去上清液
將pellet 懸浮於6ml sol.C中，並將其加至6ml sol.D中，離心3000 rpm 30min
-->去上清液
將pellet懸浮於1ml sol.E中，計算細胞數，並加入sample buffer
protocol大約是這樣
但我不能確定有沒有抽到細胞質的蛋白
※ 引述《aggaci (有氣質的台客)》之銘言：
: ※ 引述《dorphilvet ( )》之銘言：
: : 我是用不同濃度的醣讓細胞漲破，抽核蛋白
: : 我沒有用過kit，因為我們也是抽大量的
: : 但因為沒有比較過，所以不知道好不好用
: : 但比整個細胞加sample buffer下去煮還要好就是了
: : 比較乾淨
: 謝謝你
: 但是能否請教一下你們的protocol的步驟?
: 還有抽出來的蛋白會污染到細胞質的蛋白嗎
: 感謝
--
※ 發信站: 批踢踢實業坊(ptt.cc)
◆ From: 61.64.162.223
推
03/30 13:11, , 1F
03/30 13:11, 1F
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