Re: [問題] 問一個double digest的問題
※ 引述《ssuny (黑夜中的黑貓)》之銘言：
: 小弟目前正在做質體的構築
: 要利用double digest的方法將insert從構築好的plasmid(pGEM-T easy)上切下來
: 示意圖如下
: vector insert vector
: ▅▅▅▅▅│▅▅▅▅▅▅│▅│▅▅▅▅
: NdeI XhoI NdeI
: 我insert是具有NdeI以及XhoI切位
: 而在pGEM上也有一個NdeI的切位
: 因此我先用XhoI切
: 以phenol/chloroform回收
: 再以NdeI切第二次
: 可是目前遇到的問題就是.. "第二刀怎麼切都切不動"
: 切位確定是沒問題的
: 可是就是不知道為什麼怎麼做都做不出來
: 想請問一下各位版友知道這是為什麼嗎?
: 謝謝
我跟你有一樣的問題！！
我的insert 大概1000bp, 我用的系統是 pET-15B (5708bp),我用的也是double digestion
, NdeI & XhoI, 我做ligation把他接進去了，
然後我先用PCR做check, 有夾出我要的片段，然後我就在有insert 的plasmid 上
只切一刀試試看， 結果出來的片段是六千多bp, 也是符合我的預期，
但問題來了，在只有NdeI or XhoI 的情況之下，我只選用一種限制脢去切都切的動，
但是，一旦用兩種限制脢同時切， 卻就只看到切一刀的樣子，
我那個insert完全沒有被切下來，我用的溫度啊 buffer 也完全按照 NEB建議
怎麼會這樣呢？
真希望有人可以給我們建議！
謝謝
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