Re: [問題] 請問有人利用TSS製備competent cell嗎!?

看板Biotech (生命科學)作者hchs890843 (紫魚)時間19年前 (2006/08/25 00:42)推噓1(1推 0噓 2→)

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您好：非常感謝您能撥冗打了這份protocol 我想請問一下這個最後用test plasmid作測試時大約可達多高的效率呢？敝實驗室也是利用這個方法不過作出的效果慘不忍賭(本人是實驗的新手，我們的protocol跟你的長得差不多) 還有想請教你進行heat shock是多少度幾分鐘呀因為原始論文不推薦進行heat shock，對此我也有些疑惑故想問問我們實驗室是說，作這個只有兩個要件快都是冷的不要回溫像您會分裝好後先放在冰上30mins，再丟入N2中這有什麼特別的效果嗎？因為我們實驗室是沒有這樣的，學長是越快分完，然後快快丟入 liquid N2中還望先進能有所指教，非常謝謝您！ ※ 引述《enisx (嘁嘁窣窣)》之銘言： : 我常用的Protocol: (我大概每3-4個月會作一次) : 1.Day1: Incubate at 37度 on LB plate for 12-16hr. (From bacterial stock ; : JM109 or DH5alpha) : 2.Day2: Steak a single colony into 5ml of LB medium, then incubate at 37度 : for 12-16hr. : 3.Day3: Transfer 3ml of overnight culture into 200ml of LB, then incubate at : 37度 for addition 3hr or so.(OD600=0.375-0.4) : 4.Centrifuge 2500 rpm at 4度 for 10min, then discard the supernatant. : 5.Add 100ml of ice-cold 50mM CaCl2 (autoclaved) to cell pellet and : re-suspend cells completely. Place on ice for 30min. : 6.Centrifuge 2500rpm at 4度 for 10min, then discard the supernatant. : 7.Add 12ml of ice-cold TSS with 5% DMSO to cell pellet and re-suspend : cells completely. : 8.Make 200ul of aliquots and put on ice for 30min. Then, using liquid N2 to : freeze cell. : 9.Use 100ul of competent cells to perform transformation. : TSS: (Autoclaved; fresh prepared) : Stock final 150ml : PEG3350 10% 15g : MgSO4 1M 25mM 3.75ml : MgCl2 1M 25mM 3.75ml : Tryptone 1.5g : Yeast ext. 0.75g : NaCl 0.75g : ( 12ml TSS 中加入 600ul 原倍DMSO ) : ※ 引述《koele1984 (koele1984)》之銘言： : : 請問有人利用TSS(Transformation and Storage Solution : : for chemical transformation)來製備competent cell嗎!? : : 我找到了2份的protocol : : solution的配法大同小異 : : 只不過我在test efficiency時效果很差 : : 我想有幾個原因 : : 1.我當初在加PEG的時候，經過autoclave後仍有一些沒溶解 : : 2.有些protocol加完TSS後不用放在冰上20分鐘，有些有要求 : : (我加完後就直接拿去-80凍了) : : 目前找到的就這幾個問題 : : 請幫我看看.....Orz : : ps.我可以順便要TSS的protocol嗎!? : : 我想比較看看哪個比較好.... -- ※ 發信站: 批踢踢實業坊(ptt.cc) ◆ From: 218.167.136.87