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[問題] His-tag的蛋白elute不太下來

看板Biotech (生命科學)作者 (巧克力餅乾)時間19年前 (2006/09/08 23:09), 編輯推噓7(7推 0噓 3→)
留言10則, 7人參與, 最新討論串1/2 (看更多)
拜讀過前述蛋白表現相關文章 我是用BL21來表現human的His-tag蛋白 1mM IPTG在室溫表現三小時 結果也是大部分蛋白在pellet 後來sup的少量蛋白用1M imidazole 去elute下來之後發現resin上面還有很多蛋白 試過pH 4.5的改變電中性方式或高鹽或B-ME方式去elute都沒效 我懷疑蛋白根本就不只用His-tag去抓住Ni-resin 請問還有其他方式可以得到更多蛋白嗎？ 另外我試用Takara的chaperone plasmid set去co-expression 是有讓sup的蛋白量變多了 但是elute下來的蛋白還含有少量洗不掉的chaperone 而且利用那些蛋白去做EMSA實驗發現會影響蛋白的binding能力 我找到一篇paper是關於去除chaperone的方式 http://myurl.com.tw/6qc2 還在考慮該不該花心力去試這個方法 不知道有沒有先進試過類似方法 可以提供意見 謝謝 -- ※ 發信站: 批踢踢實業坊(ptt.cc) ◆ From: 140.129.74.69
推
09/09 01:11, , 1F
一般DNA binding protein可以試試看用heparin column
09/09 01:11, 1F
推
09/09 03:25, , 2F
wash時加一點detergen or high salt 干擾Chaperone用
09/09 03:25, 2F
→
09/09 03:26, , 3F
至於一直bind在resin上的protein 或許可加入少許EDTA
09/09 03:26, 3F
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09/09 03:28, , 4F
把Ni跟protein一起抓下來 再與Imidazole做dialysis
09/09 03:28, 4F
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09/09 03:28, , 5F
去除Ni 只是建議啦 應該是很濫的建議XD
09/09 03:28, 5F
推
09/09 13:19, , 6F
通常1M去elute不太可能不掉 請問你怎麼確定resin上還有蛋白?
09/09 13:19, 6F
推
09/09 18:21, , 7F
樓上的，這是有可能的！當局部蛋白質濃度太高時就會！
09/09 18:21, 7F
推
09/10 06:16, , 8F
一篇好文章 希望有用 http://0rz.net/361Oj
09/10 06:16, 8F
推
09/10 15:00, , 9F
請問dialysis時加一點點imidazole時可以去掉Ni嗎？
09/10 15:00, 9F
推
09/14 18:24, , 10F
請問七樓...多少的濃度稱為太高呢...??
09/14 18:24, 10F
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