[問題] 請問有關EMSA的實驗問題

看板Biotech (生命科學)作者phenol ( 更~~~跑哪去)時間19年前 (2006/09/23 13:28)推噓0(0推 0噓 1→)

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我是使用 roche 的DIG操作 (很多東西是我自己泡的不能泡才用買的) 我的問題是我連free probe都看不到不是髒就是一片白 (我有確定沒有跳海) 首先我做Dot Blot確定我的dig-label是沒有問題的可能跑膠後的面步驟有問題我的步驟如下希望各位先進可以指點一下 1. gel component: 5X TBE buffer 1ml 40% AC 1.5ml DD water 7.4ml 10% APS 100 ul TEMED 10 ul total 10ml 我是再跑膠的隔天就先做好膠預備做好後加0.5X TBE 保鮮膜覆蓋 4度冰箱保存 2. (running buffer:0.5X TBE) 跑膠前 pre-run 30min以上 80 V (福特數會不會太小? 我後來看了promega的好像是用350V 但他是用isotope) 3. 因為我的binding buffer沒有glycerol 因此 sample我都各 + 2 ul glycerol (my binding buffer:100mM Hepes ph7.6, 5mM EDTA, 50mM (NH4)2SO4 5mM DTT, Tween 20 1% w/v, 150mM KCl ) roche的protocol中有建議的loading buffer 但是我之前跑出來的膠更奇怪 sample+loading buffer跑出來的膠well兩側有被拖曳的現象故改用只加 glycerol 跑膠時在空well中加loading buffer 另一加protein Marker 都沒有被拖曳的現象 4.待sample跑入well中就移進cold room去跑膠未跳海前切除電源馬上transfer 大約要1.5hr 降會不會太久? 是否該調快減少時間?? 5.(Tranfer buffer :0.5X TBE) semi-dry 30mA 30V 60min /片 (一次只做一片) 6.oligonucleotides crosslinker: UV stratalinker 1200mJ (我有用Whatman 的濾紙浸泡2x SCC buffer 襯在membrane下方) 7. washing buffer wash 3min -> 1X blocking RT 30min -> anti-dig AP 1000x in 1X blocking solution RT 30 min -> washing buffer wash 10min 兩次 -> CSPD (37 degree developing 10min) -> x-ray film exposure 10~30分鐘不等 (我有試過blocking 4度 over night 比較乾淨但是一樣 no band, no free probe) 請問大家我的步驟哪裡錯了嗎? 還是哪裡可以在修正請告訴我感謝~~ 另外我想請問一下 1.dig label後要怎麼保存 -80 度分裝保存嗎? 可以放多久?? 2.我的probe 很短只有20mer 會影響結果嗎?? 3.如何confirm DNA是double-strand ?? 跑膠看EtBr有沒有卡進去??這是我幻想的拜託 ~~~謝謝大家 -- 有些事情不知道是幸福的你說呢 ? -- ※ 發信站: 批踢踢實業坊(ptt.cc) ◆ From: 61.228.110.9 ※ 編輯: phenol 來自: 61.228.110.9 (09/23 14:09) ※ 編輯: phenol 來自: 61.228.110.9 (09/23 14:10) ※ 編輯: phenol 來自: 61.228.107.180 (09/23 18:34)