Re: [求救] 我的western blotting一直做不好。

看板Biotech (生命科學)作者FromWood (木由)時間19年前 (2007/01/13 21:33)推噓0(0推 0噓 0→)

留言0則, 0人參與討論串2/3 (看更多)

※ 引述《inspire0311 (每一天都值得慶祝)》之銘言： : 我已經做western blotting一個月了， : 結果一直出現這樣的雜線? : 我問了學長，結果說我沒有用TBS洗乾淨， : 我自覺已經洗得很乾淨了。 : 為何還是這樣?請幫我看一下。 : 謝謝。 : 照片在這裡: : http://www.wretch.cc/album/show.php?i=inspire0311&b=4&f=1902925055&p=0 首先請問你做的流程? 是曾經做過正常的western blotting 或一直都長這個樣子? 我看了你的圖感覺是SDS PAGE 本身就沒有跑好你的蛋白很明顯沒有夠清晰的分開。雖然你的marker是有分開的，但marker中的蛋白本來就單純，他有分開不代表PAGE本身的分離度是好的；包括樣品處理是不是ok，以及膠本身是不是ok 1.檢查一下sample處理的過程中有沒有問題。加熱時間夠不夠，溫度有沒有到， sample buffer要不要重配等。我覺得你應該拿一些其他的來跑看看隨便收點細胞lysate來，看actin就可以了。同時可以一起跑一點BSA(10-100ng即可)，當做單一蛋白在你的樣品處理方式下的參考。首先要確認你整個實驗方法是OK的，再來看看是不是sample本身的問題。 2.PAGE本身凝結的不好，甚至Acrylamide生成就不是平均的網狀架構所以跑的都會歪歪的，也有些蛋白會順著做不好的地方一路殘留，產生你所謂縱向的線。可以檢查一下配方,同樣的配方別人跑OK嗎? 同樣的配膠溶液人家跑OK嗎? 凝膠時間是不是過長或過短? APS是否新鮮? Tris的ph值是否正確? 做一片好膠是很重要的。 3.跑電泳的時候是否溫度過高? 電流值會不會過大?有沒有可能因為過熱而degrade? (不過感覺不太像) 4.你的sample中有什麼東西濃度很高嗎? 在約40 kDa的地方有很明顯的蛋白痕跡而底下又有藍色的呈色不知那個位置是你的樣品大小的地方嗎或其實可能是因為我上面說的40 kDa蛋白過多造成的non-specific binding 可能要判讀一下訊號的真偽因為我都是壓片，沒有做過直接膜上呈色，這部分訊號的判讀可能要請高手幫忙解答^^ 5.抗體本身是不是一隻夠好的抗體? 在你圖中各處都有細小的點，我認為那都是抗體的non-specific binding。這跟你在做一抗的hybridize條件，二抗的hybridize條件，還有你wash的程度都有關係。每隻抗體的能力也不同,所以有可能要去測試找出最佳的用法。包括titer、包括反應溫度、包括時間；有的抗體就是非四度 overnight不行，有的抗體就是需要較高的tween 20來洗。另,你是用TBS來洗還是TBST洗? 既然叫做洗，就要有清潔劑喔。(不好笑，逃~) 加油囉! 其實滿多地方可以抓抓看有沒有問題的祝你實驗順利:D -- ※ 發信站: 批踢踢實業坊(ptt.cc) ◆ From: 61.219.45.10