Re: [問題] 請問用western blot偵測磷酸化蛋白

看板Biotech (生命科學)作者fodo (fodo)時間19年前 (2007/04/17 10:55)推噓3(3推 0噓 0→)

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※ 引述《liuse (充實自己，提昇自己)》之銘言： : ※ 引述《fodo (fodo)》之銘言： : : 請問使用western blot偵測phosphorylated protein kinase時 : : 每次跑出來的結果很不穩定，有時候可以看到磷酸化現象，有時候又看不到 : : 不知道是在那個步驟出了差錯？ : 請問你是要detect cellular protein phosphorylation : 還是IP kinase來進行kinase assay : 可以講詳細一點嘛 : 還有你用的抗體是染啥 : 染protein還是染phospho-Y(phospho-S/T)? : 還是特別染phospho-specific residue on kinase? : 你可以講詳細一點 : 包括你的目的，使用的materials 和tools : 這樣比較好給意見謝謝您的解釋我的實驗目的是利用病毒感染細胞株後所引發的宿主訊息傳遞路徑，希望能找出過程中有哪些protein kinase發生磷酸化。所使用的方法是，病毒感染後直接收取cell lysate，先用western blotting detect 有哪些protien 被磷酸化，因此使用anti-phosphotyrosine or anti-phosphoserine/threonine的Ab，分別進行。看跑出來的結果觀察到哪些分子量的位置有被磷酸化，再往下一步去翻paper找可能的cadidates，再用spcific phospho- Ab來篩選。例如用anti-phosphotyrosine Ab跑出來的western blotting，在60kDa的位置有變化，接著再用同樣的sample再跑一次膠，用anti-phospho-src(Tyr416)的Ab去染western blotting，看結果吻不吻合。現在遇到的問題是在同樣一批sample，用anti-phospho-src(Tyr416) Ab染western blotting時，可以看到有感染才有磷酸化，但是隔天想要立刻重複，一樣的condition重新收一批sample，一樣用同一隻Ab，卻又看不到磷酸化。可能隔幾天再收，再跑，磷酸根又被我看到了，就一直重複在"你看得到我~~嘿嘿!!你又看不到我了~~"的循環裡。跑膠用13x14cm的大型電泳，跑的protein量應該足夠。我家老闆覺得，看到磷酸化的那幾次，是病毒跟細胞剛好都調整到絕佳狀態，XD 不過我一直認為是我操作手法上出了問題，結果才會這麼不穩定。希望有經驗的學長姐可以提供一些意見，謝謝你們 -- ※ 發信站: 批踢踢實業坊(ptt.cc) ◆ From: 140.116.48.94 ※ 編輯: fodo 來自: 140.116.48.94 (04/17 11:01)