Re: [問題] pull-down與IP的討論

看板Biotech (生命科學)作者ColdP (......)時間19年前 (2007/05/25 06:53)推噓2(2推 0噓 1→)

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其實IP，GST-pull down，yeast-two hybrid作出的結果不一致其實還滿常見的，因為他們三個的實驗condition本質上有著滿大的不同... ※ 引述《Bluecold (黑特版比就可版好笑)》之銘言： : 各位版友大家好 : 現在我正在進行IP 期待利用A protein 的Ab : 可以將A protein precipitate的同時 : 也將跟他作用的B protein precipitate下來 : A與B protein之前利用GST-B protein與purified A protein : 進行pull-down以後發現的確是有direct interaction 要注意的是，在GST-pull down裡面，你的A protein和B protein的"量"相較於"正常情況"下，其實是呈現overexpress的狀態; 而protein-protein間的interaction是與protein的濃度有關係的，在濃度高的時候， non-specific binding就有可能發生... 所以A和B或許在in vivo並沒有interaction，但是在GST-pull down或是yeast-two hybrid的實驗中，由於他們被"overexpress"了，就發生了平常不會發生的interaction... : 但是剛剛利用IP卻發現他們之間沒有interaction? 除了實驗情境，這裡還要考慮到幾個問題: 1. A和B會不會在這個cell裡面碰頭? 2. 如果會，那有A的地方一定會有B嗎? 3. A和B在這個cell裡面的量有多少? 4. 有可能很倒楣的，antibody認的epitope剛好在A和B interact的區域。關於問題1，或許A和B有interact的"潛力"，但要是A和B在這個cell裡面完全不會被表現在同一個區域... 就算有潛力，終究還是不會發生interaction... 舉個例子，我不是宅在家裡就是在實驗室做實驗，在這個情況下，就算有女生喜歡我這型的人，我要交到女朋友的機率還是微乎其微... 除非我去參加某些活動，增加我接觸其他女生的機率，就像在GST-pull down中， A和B被強制碰頭在一起了... 而2和3則是要一起考慮的問題。有時IP作不出來，可能不是A和B沒有interaction，而是因為A和B的量差太多了，才造成false negative。為何這樣說呢? 舉個例子，假設B在cell中的量只有A的1/1000倍... 就算IP A的同時，B也有被Co-IP下來，但要是你loading在gel上的sample總量是"剛剛好可以看到A的band"的量，那就就算你的IP sample中同時也有B，但由於B的量差了A 1000倍，就算有B在gel上也幾乎染不到啊~ 另外，就換A和B的量沒差那麼多，假設B只少了A10倍好了，但要是並不是所有B都會和A interact，比如說只有10% B會和A interact，其他90%的B可能是被送到其他地方做別的事了... 在這樣的情況下，會和A interact的B的總量實際上只有A的1/10*1/10 = 1/100，在這樣的情況下，還是很容易出現false negative。如果是上述的情況，那你可以考慮增加sample loading的總量，在增加loading的同時，negative control也要做好，以免出現false positive。關於問題4，要是antibody認的位置剛好是A-B interaction region，這使的epitope的位置被B擋住， antibody抓不到，於是只要是和B有interaction的A antibody都抓不下來，於是只有沒和B interact的A才被抓下來，看起來就是negative結果了。如果是這種情形，那可以考慮換個antibody，或是增加IP buffer中的detergent量讓antibody binding region暴露出來， (不過相對的A-B interaction也有可能被因被此破壞) : 怪哉 : 不知道版友會怎麼解釋這個問題? : 我現在在猜想 : 1. 是否我的lysis buffer中含有太高濃度的detergen(2.5% CHAPS) : 導致干擾了A-B interaction? 我都用0.1% SDS 0.5%NP-40，還是做的出來; 雖然detergent是有可能破壞protein-protein interaction，但只是2.5% CHAPS... 如果是夠穩固的interaction，要被2.5% CHAPS破壞應該還滿難的... : 2. 我還沒wash 光是在cell lysate剛load進去離心以後就掉了 : 因此我想不會是wash的問題所以直接想說是binding的條件不對? : 因為我是用PIERCE的seize X protein A immunoprecipitation kit做的 : 接下來會想先降低我的detergen濃度再試一次 : 假如各位版友看到這樣的結果會怎麼解釋? -- ※ 發信站: 批踢踢實業坊(ptt.cc) ◆ From: 123.195.16.147