[問題] Real-time PCR的三重複

看板Biotech (生命科學)作者leondemon (狗狗)時間18年前 (2007/08/31 00:42)推噓13(13推 0噓 15→)

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三重複的意義何在？？？為什麼要做三重複？？？三重複要怎麼做？？？最近因為這個問題，跟我很在意的人鬧得有點不愉快因此想聽聽這邊的前輩的解答。我說說我的看法。我覺得三重複的意義，在於要確定每次的做出來的結果是一致的。應該說，任何實驗，都要確定其「再現性」，才能說這個結果是有意義的。因此，我有看過講究一點的paper，他們有測試同樣的reaction在不同時間上機，來確保機器在不同的時候上機，其結果會有差異。而我覺得三重複的配法，應該是要除了cDNA以外的reagents先混合配好加入各well中，然後再取三次cDNA，分別加入三個reaction中，證明每次取的cDNA都能做出一致的結果。因為PCR反應中，cDNA的初始濃度，應該是影響結果差異的最主要原因，所以針對cDNA做不同的三次加入的三重複，來確定人員沒有操作失誤，而除了cDNA以外的reagents先mix在一起，是要做到「在相同環境下，測試一個可能變數」所以如果做出來的擴增曲線是重疊的，那表示三次的操作都沒問題，若是有一條沒重疊，表示那次的pipetting可能有問題，於是排除該數據；若是三條都沒重疊，則表示結果不一致（無再現性），因此該組數據都不能用。上面是我的看法，但是我聽到有人的三重複作法跟我不同。他們是將所有的試劑混合在一起，這包括了cDNA、primer、和SYBR GREEN master mix，混合好後，直接分裝到三個well中，然後跑出來的擴增取線很完美的重疊。可是我卻覺得這樣做已經失去了「三重複」的含意，只是為了做「三重複」而做的「三重複」。因為他們從tube裡面只取了一次cDNA到整個mixture中，這樣的三重複，就不能證明，「下次再做一樣的實驗，擴增曲線會是一樣的情形」因為他們沒有做「不同次數抽取cDNA時，其擴增曲線是一樣的」畢竟cDNA的初始濃度稍有不同（可能是pipetting或人員操作技術導致），其結果可能就會有明顯差異。我覺得他們那樣的作法，只是把「同一個reaction，在同一台機器上跑三次」能證明的，頂多只有「這台機器很穩定，因為在不同的well位置，其熱循環結果一致」可是要證明這個做什麼呢？這不是這台機器「基本」應該具備的條件嗎？對每個reagent只有做一次pipetting，那要如何表示這個反應的「再現性」？根據我的實驗經驗和speciallist的指導，要降低cDNA的pipetting error，最好的方式就是先稀釋整個cDNA來源，充分混合均勻（vortex & spin down）後，再取cDNA加入各reaction中。這樣可以使原本可能只要加 0.5 ul的cDNA，變成加入 5 ul（因為cDNA稀釋10倍），這樣pipetting時，一些的些微誤差，會因為取的體積變大而降低變異係數（差異百分比）我想聽聽看各位前輩對這兩種三重複作法，有什麼樣的見解？哪一種方法是正確的？還是兩種都正確？謝謝～ -- ※ 發信站: 批踢踢實業坊(ptt.cc) ◆ From: 59.120.7.114

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aggaci

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aggaci

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leondemon

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