[求救]promoter, luciferase assay

看板Biotech (生命科學)作者bicon (不以物喜不以己悲)時間18年前 (2008/03/11 01:19)推噓1(1推 0噓 1→)

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我在研究某個gene的轉錄調控，我對細胞treat hormone，或是transfect一些factor到細胞內，接著收細胞，抽RNA，轉成cDNA做Q-PCR，看該gene是否有被induce or down-regulate，結果RNA大概可以看到上升2倍，但是因為該gene在HepG2 cells, HuH7…等Hepatoblastoma, HCC cell line內表現量非常低(但是正常liver很高)，所以protein level看不到，western blot根本壓不到，因此只能看RNA level而已，但是至少RNA看到induce。另外，我也想用luciferase assay去看是否真的符合RNA看到的情形，我們家之前有clone出大概2K的promoter，clone到pGL3-Basic，做了5 RACE找到start site，也做5 deletion去看不同片段的活性找到minimal promoter，以上是對這個promoter construct已經做過的實驗。問題是，我對這個promoter luciferase construct，做treatment or transfection，都看不到有induce的情形，也就是RNA level看到，但是 promoter luciferase assay卻看不到有作用。有可能是此調控的region 不是位在我們clone出的2K promoter，有可能在更上游或是在intron(我只能這樣解釋)。想請教大家，還有哪些實驗可以告訴我們clone出的promoter就是該gene的promoer，因為我一直懷疑，該promoter是否真的就是我想研究 gene之promoter，因為luciferase assay data 不符合 endogenous RNA data!! 苦惱苦惱謝謝大家 -- im a good student -- ※ 發信站: 批踢踢實業坊(ptt.cc) ◆ From: 140.129.62.1