[求救] semi-quantitative PCR的問題><

看板Biotech (生命科學)作者 (丹丹)時間18年前 (2008/03/28 00:08), 編輯推噓12(12012)
留言24則, 8人參與, 最新討論串1/1
在跑RT-PCR之前 我有將兩個樣品的cDNA 都以分光光度計定量到O.D = 1 我不確定這樣做對不對 但 畢竟要比較兩個樣品基因表現量 template量也要一樣多 所以我唯一想到快又方便的方法 就是這樣定量了 結果跑出來 actin (housekeeping gene) A樣品產物超多 B樣品還好 而target基因 A樣品有表現 B樣品則完全無條帶 如此結果 應該說明template量不同所造成差異.. 想請問大家 接下來我該如何做? 看樣子分光光度計似乎無法定量 或是 我應該看A樣品actin的亮度 慢慢加B樣品cDNA的量? 實驗室還沒有人做過semi quantitative PCR 所以 我只能來版上請教大家了 先謝謝回覆~^^ -- ※ 發信站: 批踢踢實業坊(ptt.cc) ◆ From: 140.120.192.30

03/28 00:30, , 1F
這很難做ㄝ!怎不用QPCR哩?
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03/28 13:59, , 2F
semi-quant應該要做cDNA的序列稀釋或是不同cycle數吧
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03/28 14:48, , 3F
請老師讓你們做Q PCR吧...
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03/28 16:56, , 4F
沒辦法做Q的話試試看Competitive RT-PCR
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03/28 22:38, , 5F
我們是以分光光度計測量RNA濃度 換算之後每管以3ug的
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03/28 22:40, , 6F
RNA下去轉cDNA 跑PCR時 只要template加入體積一樣
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GAPDH就差不多一樣亮囉!
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by the way 我覺得actin不是很適合做RNA的
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internal control 因為大部分時候細胞骨架
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表現量不會改變太大 所以actin RNA不易測到
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只要template加入體積一樣=>GAPDH就差不多一樣亮??
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細胞骨架表現量不會改變太大=>actin不是很適合做RNA的
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internal control?
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03/29 16:15, , 14F
先感謝各位意見 目前 我已經全轉cDNA了 沒有RNA可以定
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量>< 目前 Actin是十倍亮度 template加十倍 可以嗎
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03/29 16:17, , 16F
還有 我不懂 為何actin不適合呢?
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03/29 16:21, , 17F
最後...就是因為沒有設備 才會這樣作呀..T T
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actin在大部分情況下很適合
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03/29 21:16, , 19F
我學長都用ACTIN做,他跑得都不錯啊
03/29 21:16, 19F

03/30 00:55, , 20F
另外想請問 定量RNA與定量cDNA有何差異嗎?
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03/30 13:07, , 21F
RNA比較能反應真實表現 cDNA變數太多 一般人比較不相信
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03/30 13:11, , 22F
但Northern比較不靈敏 RNA太少時不能做 才有Q-PCR
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04/01 08:30, , 23F
必須先確定actin的表現量在實驗組及對照組上相同
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04/01 08:31, , 24F
為了省麻煩通常直接參考paper
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文章代碼(AID): #17wyQPVc (Biotech)
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