Re: [求救] touchdown pcr
看板Biotech (生命科學)作者davideason (Davideason)時間18年前 (2008/06/17 15:22)推噓2(2推 0噓 1→)留言3則, 3人參與討論串3/4 (看更多)
粘合溫度最高達到73度?? 嘖嘖
我不清楚您primers設計的方式與目的
不過我猜
如果是有要 引入限制媒的切位 請不要計算這幾個鹼基對的Tm
回到正題
一般我做Genomic PCR 只要微調PCR的條件 都可以很順利的有結果
假設: primers 設計時的Tm=60度(切位引入'這時'不要計算)
條件:
95度--5到10分(一般plasmid 頂多3分)
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95度--45s(一般30s)------------|
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60度--45s(一般30s) |----30 cycles
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72度--(依長度)----------------|
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73度--5分
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25度 forever
建議您可以把第一次的PCR 產物照上面,微調成您實際的情況,作一次 2nd PCR
或者
直接重新作一次 Genomic PCR
題外話,我們家學弟妹最常碰到的PCR問題,還是primers 設計
祝您實驗順利
--
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◆ From: 118.171.5.216
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