PTT職涯區 / Biotech (生命科學)

[求救]請問10公分的dish可以加多少lysis buffer下去刮呢?

看板Biotech (生命科學)作者 (vita)時間17年前 (2008/08/29 16:37), 編輯推噓11(11推 0噓 29→)
留言40則, 6人參與, 7年前最新討論串1/1
最近開始收細胞要跑磷酸化的蛋白質 上一次做的時候發現 若先用PBS刮下細胞離心後再加lysis buffer 測蛋白質濃度時 蛋白質的量非常的少 因為要做time course的實驗 所以收下來的細胞泡在PBS裡的時間比較長 所以我在想是不是因為這樣 所以蛋白質被分解掉了 所以想請問大大們 如果我直接加lysis buffer的話 要加多少的量下去刮呢? 或者是有其他更好的方法呢? 謝謝!!! -- ※ 發信站: 批踢踢實業坊(ptt.cc) ◆ From: 192.192.90.33
推
08/29 16:41, , 1F
以我的經驗而言，time course一到，就會把dish放在冰上，
08/29 16:41, 1F
→
08/29 16:42, , 2F
吸掉medium，用PBS wash兩次，之後再加入30-50μl的lysis
08/29 16:42, 2F
→
08/29 16:44, , 3F
buffer，而我用的dish是35mm的…細胞數有點忘了，但是夠跑
08/29 16:44, 3F
→
08/29 16:45, , 4F
WB至少兩次(一次20μg)…
08/29 16:45, 4F
→
08/29 16:46, , 5F
但是你先用PBS刮下細胞離心後再加lysis buffer…有可能在
08/29 16:46, 5F
→
08/29 16:48, , 6F
你刮下細胞的同時就把細胞給打破了，而protein跑到PBS，
08/29 16:48, 6F
→
08/29 16:48, , 7F
這樣子的話測出來的濃度就很少了，或者是你的treatment會
08/29 16:48, 7F
→
08/29 16:49, , 8F
會使細胞死亡，protein的量也會減少…
08/29 16:49, 8F
→
08/29 16:51, , 9F
事實上，在你用PBS wash細胞，再吸掉的同時，不會完全的吸
08/29 16:51, 9F
→
08/29 16:52, , 10F
PBS，所以當你再加入lysis buffer的量，就要考慮一下了…
08/29 16:52, 10F
推
08/29 17:06, , 11F
很多lab都刮下後wash完再lyse,顯然會lose是操作上差異造成
08/29 17:06, 11F
→
08/29 17:08, , 12F
還有如果要考量殘餘PBS來斟酌lysis bu,不擔心濃度不對嗎？
08/29 17:08, 12F
推
08/29 17:20, , 13F
呵呵…不過前實驗室的做法是這樣…也跑的出來…
08/29 17:20, 13F
推
08/29 17:21, , 14F
treatment會造成細胞lose養多盤一點就解決了
08/29 17:21, 14F
→
08/29 17:21, , 15F
所以…我想這是結果論吧…假如能成功完成實驗…就是好方法
08/29 17:21, 15F
→
08/29 17:22, , 16F
我養４盤10cm dish還經過IP.磷酸蛋白一樣可以偵測到
08/29 17:22, 16F
→
08/29 17:22, , 17F
考量殘餘PBS來斟酌lysis buffer，是指10mm dish殘留量會高
08/29 17:22, 17F
→
08/29 17:23, , 18F
不過這是OE蛋白 要偵測正常蛋白的磷酸會加到10盤
08/29 17:23, 18F
→
08/29 17:23, , 19F
些，所以要protein濃度高一些相對體積要少一些…
08/29 17:23, 19F
→
08/29 17:24, , 20F
另外PBS是可以完全吸乾 wash時轉到eppendorf再用
08/29 17:24, 20F
→
08/29 17:24, , 21F
不擔心濃度不對？跑之前不是會測濃度嗎？不太懂這個疑問…
08/29 17:24, 21F
→
08/29 17:25, , 22F
suction抽乾就好
08/29 17:25, 22F
→
08/29 17:27, , 23F
不過比較好奇做time course為何不立即加入lysis後再
08/29 17:27, 23F
→
08/29 17:27, , 24F
凍到-80 還要泡在PBS理?? 這樣不是會讓細胞代謝繼續?
08/29 17:27, 24F
推
08/29 17:33, , 25F
回v,任何lysis bu都有配方濃度,在dish直接作用肯定會受PBS
08/29 17:33, 25F
→
08/29 17:35, , 26F
大大影響salt,detergent濃度除非在tube才降低PBS影響至最低
08/29 17:35, 26F
推
08/29 17:38, , 27F
所以這就是實驗啦~~黑貓白貓能捉到老鼠的就是好貓~~呵呵
08/29 17:38, 27F
→
08/29 17:39, , 28F
至於t提到磷酸化,一般商業化P抗體要是這樣,可能很難賣出去
08/29 17:39, 28F
推
08/29 17:47, , 29F
XD 10盤量是因為本身seeding時有控制數目 藥物處理後
08/29 17:47, 29F
→
08/29 17:47, , 30F
又純收貼附細胞 外加要求一次sample至少可以跑三次
08/29 17:47, 30F
→
08/29 17:48, , 31F
實驗條件case by case
08/29 17:48, 31F
推
08/29 20:37, , 32F
除非做IP-mass spec,如果做w還要用這麼多盤,真的建議你找代
08/29 20:37, 32F
→
08/29 20:39, , 33F
理商求技術支援,或藉以詢問用過此磷抗的lab,不然這太可憐了
08/29 20:39, 33F
推
08/29 21:09, , 34F
是w->mass沒錯- -a
08/29 21:09, 34F
→
08/29 21:10, , 35F
另外我局的protein多收有益無害吧? 一次就壓出來總
08/29 21:10, 35F
→
08/29 21:11, , 36F
每次都拿一咪咪試不出來好
08/29 21:11, 36F
推
08/30 00:19, , 37F
可以加到60 ml, 快滿但是不會滿出來
08/30 00:19, 37F
推
08/30 23:56, , 38F
各位高手，能用回文的方式嗎？t和v兩人竟然還一行夾一行...
08/30 23:56, 38F
→
11/11 00:57, , 39F
除非做IP-mass https://muxiv.com
11/11 00:57, 39F
→
01/03 16:44, 7年前 , 40F
實驗條件case by https://noxiv.com
01/03 16:44, 40F
‣ 更多 vita221 的文章
文章代碼(AID): #18jxKvCr (Biotech)
Biotech 近期熱門文章
更多 近期熱門文章 >>
PTT職涯區 即時熱門文章
更多 即時熱門文章 >>
‣ 更多 vita221 的文章
文章代碼(AID): #18jxKvCr (Biotech)