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[求救] CIAP之使用

看板Biotech (生命科學)作者 (梅子)時間17年前 (2008/09/21 14:05), 編輯推噓13(13推 0噓 26→)
留言39則, 8人參與, 7年前最新討論串1/1
想要進行Ligation 載體是用pET-29 我的限制酶切點是 Nde I & HindIII 想要利用CIAP去作用，以免載體自黏 請問~ 是要作用vector就好嗎??insert需要用CIAP處理嗎? 還有 作用順序上 是vector用酵素切完之後(我是用double digestion) 再用CIAP去作用嗎?? 已經卡在這地方好久了 正在找出可能的問題點 酵素cleavage的部分 應該是有切動 所以~猜測是在ligation的部分沒接上去 都是載體自黏的... 所以才想說試試CIAP 希望有經驗的大大們!! 幫我解個答吧!!感恩感恩~多謝多謝了 -- ※ 發信站: 批踢踢實業坊(ptt.cc) ◆ From: 140.130.38.65
推
09/21 14:11, , 1F
其實仔細想想CIAP的作用 你的問題就可以迎刃而解 Orz
09/21 14:11, 1F
→
09/21 14:25, , 2F
恕我愚笨...作用機制大概了解，不過想再釐清一點 謝了
09/21 14:25, 2F
推
09/21 14:37, , 3F
vertor就好
09/21 14:37, 3F
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09/21 14:37, , 4F
vector
09/21 14:37, 4F
推
09/21 15:42, , 5F
痾 沒有嘲弄的意思Orz 只是假設insert的P也拿掉
09/21 15:42, 5F
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09/21 15:43, , 6F
那他要如何跟P也拿掉的vector接合 另外在未切開的V中
09/21 15:43, 6F
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09/21 15:43, , 7F
加入CIAP 他找不到P位置也就沒作用吧Orz
09/21 15:43, 7F
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09/21 17:03, , 8F
恩恩!!!了解 感謝了
09/21 17:03, 8F
推
09/21 17:47, , 9F
其實兩端切點不同，有必要做CIP嗎？？
09/21 17:47, 9F
推
09/21 18:02, , 10F
轉型過後check tansformants他們都是載體自黏嗎？
09/21 18:02, 10F
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09/21 18:03, , 11F
那你覺得有沒有可能是有一個酵素其實沒有切動？兩個切點有
09/21 18:03, 11F
推
09/21 18:05, , 12F
靠很近嗎？要不要分兩次切....？
09/21 18:05, 12F
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09/21 18:57, , 13F
因為check後!就只有一條band且是剛好載體的大小所以
09/21 18:57, 13F
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09/21 18:58, , 14F
應該是載體自黏了
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09/21 18:59, , 15F
至於有酵素沒切動..也是我擔心的地方~insert切點距離1.5KB
09/21 18:59, 15F
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09/21 19:00, , 16F
分兩次切..也試過了.結果還是一樣沒接上
09/21 19:00, 16F
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09/21 19:01, , 17F
會想作CIAP是因為~不知道下一步該怎麼走了..才想說用它試試
09/21 19:01, 17F
推
09/21 20:24, , 18F
CIAP活性很強、不易去除
09/21 20:24, 18F
推
09/21 22:33, , 19F
check有沒有切動如果是我的話，我會做對照。1).NdeI切
09/21 22:33, 19F
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09/21 22:34, , 20F
2).HindIII切，3).兩個一起切。三個都要能切動才行
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09/21 22:35, , 21F
當然兩個酵素一起切，buffer要都適用....我覺得切點不同自接
09/21 22:35, 21F
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09/21 22:36, , 22F
機率應該很低......問一下你的transformants多嗎？
09/21 22:36, 22F
推
09/21 22:50, , 23F
大部分人都是從MCS切兩刀,就算有單切對照跑gel,通常都看不
09/21 22:50, 23F
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09/21 22:52, , 24F
出差異,除非是transform方式來確認,但這就樣更複雜麻煩了
09/21 22:52, 24F
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09/21 22:54, , 25F
除非少有挑到vector only,不然加CIP只要0.5~1h方便不麻煩
09/21 22:54, 25F
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09/22 08:22, , 26F
我的Transformant不多.
09/22 08:22, 26F
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09/22 08:24, , 27F
想問一下 vector only是指說~接出來的只有vector沒insert?
09/22 08:24, 27F
推
09/22 08:41, , 28F
Blence的意思是實驗組挑到vector selflifation情況
09/22 08:41, 28F
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09/22 08:42, , 29F
極少(在有CIAP條件下) 要確認CIAP是否做用完全就另外
09/22 08:42, 29F
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09/22 08:43, , 30F
把CIAP處理完的vector一樣ligation後transform
09/22 08:43, 30F
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09/22 08:44, , 31F
通常只會長個位數顆甚至沒有(前提是enzyme要作用完全
09/22 08:44, 31F
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09/22 09:01, , 32F
OKOK有了解了!!謝謝唷
09/22 09:01, 32F
推
09/23 10:58, , 33F
vector ligation前,55度加熱5分鐘後再使用即可
09/23 10:58, 33F
推
09/23 11:02, , 34F
不需使用到CIAP,前提是有切乾淨的情形下
09/23 11:02, 34F
推
09/23 15:38, , 35F
對後～～我終於知道為什麼我會覺得自接機率低了
09/23 15:38, 35F
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09/23 15:38, , 36F
因為我總是enzyme加多，作用時間加長，確保切的乾淨
09/23 15:38, 36F
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09/23 15:39, , 37F
我製備的vector發生自接機率蠻低的XD
09/23 15:39, 37F
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11/11 01:00, , 38F
不需使用到CIAP,前 https://noxiv.com
11/11 01:00, 38F
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01/03 16:45, 7年前 , 39F
//noxiv.com http://yofuk.com
01/03 16:45, 39F
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