[求救] ligation一直失敗
我的insert只有大約60bp左右
要接進去pEGFP-N3(4.7kb)
切位是EcoRI和BamHI
由於insert是直接找生技公司訂製合成的oligonucleotides
所以insert兩端原本就帶有EcoRI和BamHI的sticky end
而pEGFP我是使用上述兩種RE double digestion 2h
再進行切膠回收
使用T4 DNA ligase進行ligation
室溫overnight
問題來了
我試過很多條件總是接不進去!
我原先將insert做10倍稀釋
試過下列兩種條件
insert 2ul + vector 1ul (total 10ul) → 學姐給的protocol
insert 14ul + vector 1ul (total 20ul) → 根據公式計算
公式為[insert]*V1/insert size : [vector]*V2/verctor size = 3:1
而insert和vector的濃度是根據電泳圖大約推測相差幾倍
transform後塗plate只有長2、3個colonies
我全部挑起來抽plasmid再以RE check
結果是失敗！(跑電泳看不到insert band)
跟學姐討論也討論不出所以然來
只長2、3個colonies應該不至於是vector自接吧？！
後來我懷疑會不會是insert濃度太低所以接不進去
(因為insert 10X稀釋後跑電泳出來的band非常非常淡)
我就不把insert做10倍稀釋
直接做ligation
insert 2ul + vector 1ul (total 10ul)
transform後塗plate只有長2、3個colonies
我全部挑起來抽plasmid再以RE check
結果電泳跑出來還是看不到insert的band
最後學姐叫我拿去定序定看看好
今天收到定序單比對後發現真的沒有接進去
從EcoRI到BamHI這段序列是完整的
所以有沒有可能根本沒切開？
但是EcoRI和BamHI很容易切開不是嗎？
對了我在RE digestion後跑電泳是使用2% gel跑15分鐘
使用同樣的條件單跑insert是看得到band
所以不可能是insert太小跑電泳流掉了
懇請指教謝謝！
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◆ From: 140.120.117.206
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