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[求救] pET29純化

看板Biotech (生命科學)作者 (梅子)時間17年前 (2009/03/03 16:36), 編輯推噓5(5推 0噓 8→)
留言13則, 6人參與, 7年前最新討論串1/2 (看更多)
目前已把目標基因(1.5kb)接到pET29載體上 也已經表現出來 形成 inclusing body 目前想說先把蛋白純化出來 打小白鼠作抗體 蛋白有確定有表現 但就是純化不出來 我用的是 talon resin 進行純化 基因架接的方式..有點難敘述 用圖檔呈現囉 http://photo.xuite.net/bio.f21/3108685 我都有把我目標基因的stop codon給去掉 不知道這樣的設計有哪邊可能出問題? 麻煩大家幫幫忙了 謝謝 我純化方式： 菌液離心取沉澱物 以tris回溶 破菌 之後再離心 沉澱物用含有guanidine hydrochloride的buffer回溶， (6M guanidine hydrochloride 20mM Tris 0.5MaCl 5mMimidazole 1mM B-me) 之後就作管柱純化! -- ※ 發信站: 批踢踢實業坊(ptt.cc) ◆ From: 140.130.38.65
推
03/03 17:51, , 1F
你inclusing body有先用urea溶掉嗎?
03/03 17:51, 1F
→
03/03 21:40, , 2F
我用guanudine-HCl先溶
03/03 21:40, 2F
※ 編輯: bbiioo 來自: 140.130.38.65 (03/03 21:47) ※ 編輯: bbiioo 來自: 140.130.38.65 (03/03 21:48)
推
03/04 00:42, , 3F
1.先檢查His-Tag有沒有in frame 2.直接黏在蛋白後表現的His
03/04 00:42, 3F
→
03/04 00:43, , 4F
Tag有時候因為跟前面的蛋白太近會干擾其純化效率
03/04 00:43, 4F
→
03/04 00:45, , 5F
3.Tag若包在inclusion body內=無解,請拿soluble form試試
03/04 00:45, 5F
→
03/04 09:25, , 6F
恩..1.應該是有in frame 3.有用guanidine-HCl先溶
03/04 09:25, 6F
推
03/04 23:08, , 7F
用10oC表現你的蛋白質試看看
03/04 23:08, 7F
推
03/07 15:45, , 8F
恩?回溶的buffer有imidazole?去掉試試看 可能你的protein
03/07 15:45, 8F
→
03/07 15:46, , 9F
binding太弱
03/07 15:46, 9F
推
03/07 15:50, , 10F
喔對！管柱純化過程的buffer都有含guanudine-HCL嗎？
03/07 15:50, 10F
→
11/11 01:19, , 11F
用10oC表現你的蛋白 https://muxiv.com
11/11 01:19, 11F
→
01/03 16:52, 7年前 , 12F
//muxiv.com
01/03 16:52, 12F
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01/03 16:52, 7年前 , 13F
01/03 16:52, 13F
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[求救] pET29純化
bbiioo
17年前, 03/03
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