[求救] southern的問題
請教版上各位前輩
我正在做southern 測定mouse的DNA片段
可是效果一直很差 很不穩定
有時酵素切不動 雜交也不完全
每次做的結果都不大相同 = =a
以下是實驗步驟和條件
切酵素:
total :200 ul
DNA:5 ug (大約7 ul)
酵素：分別是 EcoRI HindIII BanHI 分三管各2ul
bfr:20 ul
作用溫度：37度
時間：18~24小時
有時候切的動 有時切不動...
之後會用isopropanal 和70% 酒精 沉澱純化 回溶在15 ul的2D水
步驟:
1.加入3M NaoAc 10 ul及ice isopropanal 200 ul
2.置於-80度 20min
3.4度C 高速離心 15min後去除上清液
4.加入70%酒精 200 ul 輕輕搖晃30次左右
5.4度C高速離心 15min 去上清液
6. air-dry後溶於2D水
純化後都有跑膠測試，看起來都沒問題
之後就直接跑大片膠轉膜了(用的是Assembling the Transfer unit,用抽氣機)
雜交是用Roche的Kit
請問...這樣看的出有什麼問題嗎?
個人認為 酵素切不動是不是總體積太小?
還有...有什麼因素會影響到雜交呢?(除了溫度以外)
--
※ 發信站: 批踢踢實業坊(ptt.cc)
◆ From: 140.130.98.90
推
04/07 11:19, , 1F
04/07 11:19, 1F
→
04/07 11:28, , 2F
04/07 11:28, 2F
→
04/07 11:30, , 3F
04/07 11:30, 3F
→
04/07 11:34, , 4F
04/07 11:34, 4F
→
04/07 11:35, , 5F
04/07 11:35, 5F
→
04/07 11:35, , 6F
04/07 11:35, 6F
推
04/07 12:25, , 7F
04/07 12:25, 7F
→
04/07 12:26, , 8F
04/07 12:26, 8F
推
04/07 13:56, , 9F
04/07 13:56, 9F
推
04/07 16:32, , 10F
04/07 16:32, 10F
→
04/07 16:34, , 11F
04/07 16:34, 11F
→
04/07 16:36, , 12F
04/07 16:36, 12F
推
04/07 16:49, , 13F
04/07 16:49, 13F
→
04/07 16:51, , 14F
04/07 16:51, 14F
→
04/07 17:44, , 15F
04/07 17:44, 15F
→
04/07 17:45, , 16F
04/07 17:45, 16F
→
04/07 17:47, , 17F
04/07 17:47, 17F
推
04/08 10:27, , 18F
04/08 10:27, 18F
→
04/08 10:29, , 19F
04/08 10:29, 19F
→
04/08 10:31, , 20F
04/08 10:31, 20F
→
04/08 10:32, , 21F
04/08 10:32, 21F
→
11/11 01:23, , 22F
11/11 01:23, 22F
→
01/03 16:53,
7年前
, 23F
01/03 16:53, 23F
Biotech 近期熱門文章
PTT職涯區 即時熱門文章
67
145