Re: [求救] 3'RACE

看板Biotech (生命科學)作者andy731 (闇黑小喵喵)時間17年前 (2009/06/10 17:41)推噓0(0推 0噓 2→)

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※ 引述《newpostt (T.T)》之銘言： : 我有一個case A是gene translocation (EWSR1+未知) : 想用3'RACE去定序找出來 : case B已知是EWSR1+FLI1 拿來做control : case C則是kit裡面附的RNA : 我用的是invitrogen的3'race : 第一步從RNA->cDNA : 我用b-actin去做PCR : A和B都有得到band (證明我的cDNA還不錯?) 我想~這只能證明你有成功的逆轉錄出cDNA而已 : C用GSP和AUAP做PCR 都有得到很好的band (表示我的RACE應該有成功?) 很好的band? 怎樣的band 分子量正確嗎? 既然很好那何必在做nested PCR? 還有GSP是否確定是在EWSR1 上游? : 再來我用EWSR1+AUAP當primer : 可是A和B都沒有出來 : nested PCR有沒有得到好的band : 有淡淡的smear感覺 : 我現在就很迷惑 : 如果說是未知的基因很長 : 導致PCR結果出不來 : 這就很難解釋為什麼case B EWSR1+FLI1會出不來 : 預期大概是700左右bp : 我的elongation用2分鐘了 : Tm 60 ^^^^^ 這是指annealing temp.? 設定60度個人感覺好像有點高了.... : 不知道要怎麼做troubleshooting >"< : 我目前是嘗試想換另一種PCR enzyme (HotStar) : 不知道幫助大不大 : 有沒有人有經驗可以幫忙不曉得你的基因表現量是如何? 很低嗎? 既然你有控制組建議不妨先把控制組條件抓出來我在猜測可能是第一次PCR(GSP + AUAP)的時候沒有順利的增幅您的目標片段這是很常見的狀況~ annealing溫度是否太高或太低? 另外換好一點的Taq有助於RACE的成功建議您可以多試幾組Taq : 另外 : 我有一個很新手的問題 : PCR之後都會去做clone : 為什麼不能直接送定序呢 : 是因為會在膠上得到多於一個band嗎 : 還是有其他原因 : 如果只有一個sharp band可以直接送定序嗎 : 謝謝! 這個真的是很新手的問題建議您去找一下定序儀定序的原理還有看一下實驗室學長姐的定序資料 -- ※ 發信站: 批踢踢實業坊(ptt.cc) ◆ From: 220.143.22.185