Re: [求救] 收medium去跑western,maker變型了!

看板Biotech (生命科學)作者SPK (雲淡風輕)時間16年前 (2009/06/28 01:33)推噓2(2推 0噓 0→)

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※ 引述《wenhaoshen (wenhaoshen)》之銘言： : 我有一個問題，就是我要收細胞分泌到medium的x152蛋白質， : 經過用含10%FBS medium培養CHO-K1三天後, : 收集起來,並用0.22 um filter過濾及濃縮後, : 拿去跑western, 結果跑膠造成旁邊的maker嚴重變形變很細, : 而且size不準, : 而且有些抗體hybrid結果都沒有出來 : 我是推斷是serum造成的, : 但是無法用無serum的medium去養CHO細胞, : 因為細胞這樣會死掉, : 請問有經驗的學長姐該如何解決呢? 看了你兩篇文章，總覺得你的實驗設計都怪怪的~~ 首先，你必須在培養時把血清降到最低，或是在要收之前換成serum free的medium，應該不會那麼快就死給你看~ 要收supernatant還用到10% serum那有收跟沒收是一樣的~因為到時你收下來的東西絕大多數都是serum裡的蛋白質~~ 還有啊，我看不懂你過0.22是要幹嘛，做western又不需要無菌，用collen concentrate 後就可以凍存或是直接測濃度、處理跑膠了啊~分片段濃縮時就會loss不少了，之前還跑0.22過濾會讓你更大量的loss~~ marker變形跑掉表示你的sample蛋白質太多或是你的SDS-PAGE濃度配太高、跑太快~都有可能。抗體HY不出來的確有可能是SERUM造成，可能就是沒跑開一大砣把它蓋住了，抗體當然找不到目標囉。先去掉你的serum的影響，然後盡量的去調整你concentrate的蛋白大小片段，盡量排掉其他沒用的部分，然後再去試，跑western時smaple濃度不要太高，不要有空well（load 空sample loading dye）不要跑太快、調整sds-page濃度……等，你的這個實驗有很多需要改進的地方。 -- ※ 發信站: 批踢踢實業坊(ptt.cc) ◆ From: 219.69.66.235