[求救] 有關western blot 問題請大家幫幫忙

看板Biotech (生命科學)作者coconutt (人生就是挑戰挑戰)時間16年前 (2009/07/05 21:38)推噓5(5推 0噓 21→)

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大家好因為工作所以開始接觸western blot 大約快兩個月之前只有在教科書紙上談兵現在用的protocol是實驗室建立起來的當初有看實驗室的人做過但是大約做了兩個月的我一直有幾個問題搞不定弄的自己心煩老師也不耐煩想請各位高手指點一下問題到底出在哪邊？ 1.首先在收蛋白質部分我收的量每次都低於200ug？先講我的方法: 我將"10 cm dish" "八成"滿且細胞不是很大的dish,去medium, wash PBS,在去掉PBS,後加入1ml的PBS,刮下（有用顯微鏡確認都刮下）離心5000rpm 5min,去PBS後依照pellet加入MENT+Protein inhibitor cocktail(1000:10)大約都加50-100ul並打很散,而後放在冰上每十分鐘又去強力衝pellet,共30分鐘,而後甚至放到-80度冷凍15分鐘在解凍（現在我還加上sonicate 10分鐘每十秒休息五秒然後13000rpm 30分鐘吸上清液（有小心不吸到pellet)只是有時候液面好像有一層膜,那到底是什麼東西？之後就2ulsample protein+ 18ul ddw +480 ul Bio-rad protein assay 測吸光值每次R大約在0.975-0.995（每次都做standard) 但每次我的蛋白質量都低於200ug.....真的很想哭每次做三次就沒了？到底問題出在哪邊呢,實驗室每個人也是這樣做他們都可以收到500ug以上,請大家幫幫忙謝謝 2.再者更嚴重的問題是,到目前為止我的tubulin 總是不會等量真的除了手殘外沒有其他原因了嗎？到目前不下跑過20多遍的western blot,但每次的tubulin都不 equal,所以每次壓出來想看的蛋白都無法比較,讓老闆非常不滿. 我還是把我的作法講一下請大家提點一下,其中有幾個小問題也麻煩大家解答一下我會算好50ug蛋白所需要的ul加入4xdye,補lysis buff都到40ul離心,夾防爆夾煮沸 10min,放冰上,再離心,然後加入well內,問題來了,明明我每個sample理論上應該都是 40ul但是每次在pillet入well時都不到40ul,我問我同事他們說裡應該都超過,但為什麼我會不足？（我有確定並沒有加錯或是沒有加到）所以到底為什麼會不足呢？之後跑80V 5%stacking gel理論上應該我的loading的sample應該此時都聚集一條線, 而後才會進入10%的下膠但是我發現我們家跑的都有拖很長（大約3/4個well長度),一直到下膠跑到最後的1/4處才會慢慢壓成一條線？請問這是正常的嗎？是哪邊出了問題？這會影響到我的結果嗎? 之後就用300mA轉3小時然後blocking 1hr,wash three times,加入一抗4度overnight 隔天wash three times, 二抗一小時,wash theree times again然後ECL顯影然後心情就開始不好了......因為tubulin都不equal(因為我要壓的有在20-30kb 所以沒壓actin 很感謝你把這篇文章看到這邊,如果你有任何想法或是哪邊有問題,我會馬上再解釋清楚也希望你覺得我哪邊可以怎麼做也麻煩你解答一下...十分感激你謝謝大家 -- ※ 發信站: 批踢踢實業坊(ptt.cc) ◆ From: 123.205.33.179

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