[求救] GST pull down assay 問題...
我要做protein protein direct interaction
純化兩個protein : A protein 是 small G protein(22KD)帶 His tag
B protein 是 帶 GST tag
A protein 純化過程:
菌suspension在binding buffer(imidazole.tris-HCl.NaCl)+protease inhibitor
冰上sonication
Ni-NTA純化
elution(160 mM imidazole-印象中.tris-HCl.NaCl)
a)elution的protein加入離心管(Amicon)去換成PBS,順便想要寄降低imidazole濃度
b)沒有換buffer
B protein純化過程:
菌suspension在PBS+PI(protease inhibitor)
冰上sonication
離心,上清液和beads在4度binding 2 hrs
PBS wash 3 次,beads suspend在PBS
問題:
1.A protein與GST only beads 4度結合2 hrs,PBS+1mM DTT+1%tritonX100 wash3次
2Xsample bf去煮beads.跑膠還有A protein signal.就是negtive control做不好.
會不會是A protein 太小卡在bead,怎麼洗都洗不掉......>O<
2.有換buffer的必要嗎??看別人家好像都有換.imidazole多會影響binding?
3.reduced Glutathion去elute跟直接煮bead有差嗎?
感謝看完....我已經在GST pull down徘徊已久.....
希望能早日脫困~謝謝
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