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[求救] RT-PCR出不來

看板Biotech (生命科學)作者 (為了部落!)時間16年前 (2009/11/18 00:09), 編輯推噓8(8推 0噓 26→)
留言34則, 9人參與, 7年前最新討論串1/2 (看更多)
小弟我是用Trizol抽cell line的RNA 目前遇到的困難是抽出來去測RNA濃度和260/280的值都不錯 但是RT-PCR之後跑B2M卻沒東西,我有拿之前轉得出來的RNA當positive control 測過RT,PCR則再拿這個positive control轉完的cDNA加上別人跑過確定有東西的 cDNA來當兩組positive control,最後結果這兩組都有東西,但我的sample還是 連個鬼影子都沒有,請問有大大知道到底是怎麼回事了嗎? 底下附上我整個實驗流程: cell line:HepG2 -> 10cm dish cell + 1ml trizol -> 4'C 12000rpm 10mins -> 取上清液,室溫5mins,+200ul chloroform 輕搖15 secs,室溫3 mins -> 4'C 12000rpm 10mins -> 取上清液,+200ul isopropanol,室溫5 mins -> 4'C 12000rpm 10mins -> 吸掉液體,+1ml 75% Ethanol wash pallete -> 4'c 9000rpm 10mins -> 去除Ethanol,將pallete air dry -> +DEPC水20ul,測RNA濃度 -> Hep G2 : 2859.6ng/ul 260/280:1.95 260/230:2.03 -> RT步驟:DEPC水+dNTP+oligo dT+RNA=13ul ->65'C 5mins , 4'C 1mins , +5X buffer 4ul和0.1M DTT 2ul ->37'C 5mins , +1ul MMLV ->37'C 50 mins , 70'C 15mins -> PCR步驟:DEPC水39.5ul+dNTP2ul+10X buffer 2ul+primer 2ul+cDNA2ul+Tag0.5 ul ->95'C 30secs , 58'C(B2M primer)30secs , 72'C 30secs , 35 cycle 72'C 10mins -> 8ul產物跑膠 以上就是我整個流程,希望各位大大們能提供給我些意見幫忙解決這問題 照理來說有濃度和吸光值應該就有RNA,而且值還不低,怎麼可能跑出來連simir和 dimer都沒有!?若是RT-PCR中間的過程有錯,那positive control怎麼可能出得來? (我那組positive control的RNA是拿我以前惟一一次抽出來而且跑得出來的同種細胞 的RNA來轉, cDNA的則是拿別人跑過PCR確定出得來的來P) 我已經快沒辦法可想了..... -- ※ 發信站: 批踢踢實業坊(ptt.cc) ◆ From: 219.70.125.197
推
11/18 00:34, , 1F
你的第一步好奇怪 細胞加完TRIZOL後需要離心嗎?
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11/18 00:35, , 2F
我加完trizol後會靜置,然後加chloroform做你後面的步驟
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11/18 00:38, , 3F
你chloroform加了以後可以擺約10分鐘 等分層出現後再離心
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11/18 00:42, , 4F
然後你的isopropanol體積也不太對 至少要500ul的體積
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11/18 00:43, , 5F
如果你的trizol是1ml:chloroform 200ul:isopropanol 500ul
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11/18 01:08, , 6F
先跑膠看看抽出來的RNA品質如何..有沒有兩條明顯的亮帶
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推
11/18 06:30, , 7F
你260/280多少？ 有沒有看260/230 另外就是第一步有問題
11/18 06:30, 7F
推
11/18 08:42, , 8F
Primer OK嗎? or RNA降解掉了，260有值只能說是有核甘酸啊
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11/18 09:20, , 9F
260/280:1.95 260/230:2.03 我RNA是測完馬上轉RT的
11/18 09:20, 9F
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應該不可能置冰上五分鐘內降解光，primer的話我control組
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都有轉出來band而且很亮啊,只有sample組一片乾淨
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而且我做了一組negative control,cDNA用水代替,跑出來跟我
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跟我sample組一樣乾淨
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推
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我猜是都降解光了 最好全程冰上操作 我之前也搞很久才做出來
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11/18 14:52, , 15F
加完trizol離心是多餘的 細胞前一天換medium mRNA量會比較多
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11/18 14:54, , 16F
RT過程 如果可以 用2X以上反應(體積x2) 效果會比較好
11/18 14:54, 16F
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11/18 23:45, , 17F
從我測完吸光值到放進去轉RT才5分鐘而且是冰上,不可能解光吧
11/18 23:45, 17F
推
11/19 00:44, , 18F
還是建議你跑個RNA電泳 看看品質 感覺你的RNA可能斷光光
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斷光光的RNA一樣還是有吸光值 但是那個"質"就不一樣了
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11/19 00:48, , 20F
而且你還用oligo dT去drive RT反應 斷光光的話根本做不出
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完整的cDNA pcr更遑論是夾出你要的片段了
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一邊設計pcr片段不會設計在尾端附近
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11/19 00:51, , 23F
這可能是你怎麼跑都跑不出來目標片段的原因 參考一下吧
11/19 00:51, 23F
推
11/19 14:45, , 24F
RNA無時無刻都在逐漸降解 從你抽取的過程就開始了
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11/19 14:47, , 25F
所以動作不夠快建議放冰上 放在室溫不會比較好
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11/20 16:10, , 26F
negative control應該用 沒轉RT的RNA才對 你的tip是專用的?
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11/20 16:12, , 27F
isopronal 通常是1:1體積加入
11/20 16:12, 27F
推
01/06 10:11, , 28F
建議RNA跑膠確認順便看看有沒有DNA contaimination
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01/06 10:12, , 29F
另外你的primer長度多少?太長或太短都會造成專一性不好
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或者dimer情況太嚴重 也是有可能,順道一提
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01/06 10:13, , 31F
如果只是一般RT-PCR還適用AMV吧M-MLV效率有比較差一些
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推
01/06 10:15, , 32F
這種基礎實驗的問題反而是最難抓的,祝好運喔
01/06 10:15, 32F
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11/11 01:51, , 33F
所以動作不夠快建議放冰 https://noxiv.com
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01/03 17:03, 7年前 , 34F
2.03 我RNA是測 https://noxiv.com
01/03 17:03, 34F
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radan
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