[求救] 關於qPCR的問題 18S 的expression 出問題?
關於qPCR 很奇怪的狀況
小弟我最近qPCR 遇到很奇怪的狀況 想請問各位先進的意見
小弟我目前的實驗室 有把我們要研究的某基因在MCF7 上做Stable expression
稱之為O2 那empty vector control稱之v2 我接下來用o2/v2稱呼其
自從年中(8月)開始
我們實驗室取新的o2/v2測該基因的qPCR表現程度
一切都如預期的 o2的表現量是v2 的8倍
這個正卻性很高 因為我們實驗室除了我以外另外一個助理也一樣測出相同的效果
後來用western blot看蛋白質的表現量也有明顯的不同
但是自從9~10月開始
我又從新用qPCR測該細胞的表現狀況
赫然發現我做不出來
02/V2的表現狀況盡然差不多
當時我和我老闆討論後認為可能是我們QPCR機器出問題(當時也的確出了一點問題)
太久沒有calibration (大概5年以上沒有人去calibrate過)
所以我停做qpcr一個月 直到11月中我重新calibrate
然後我再上個星期又做了一次
結果這次結果還是一樣 O2/V2的表現狀況還是1:1 做不出8倍
但是我回頭看這幾次的原始SDS檔案
我發現很有趣的事情
凡是我們實驗室每次有做成功 每一個sample 18S CT VALUE 都是5左右
我做失敗的 每一個sample的18s CT value 都是8上下
所以我的假想是
可能我做實驗到抽RNA這段期間
細胞發生了一些狀況
導致細胞的expression pattern產生變化
等致就連不因該變動的18s 表現狀況都出問題
ct value 從5 降到8 表現量可視降了2的三次方倍
當時我跟我老闆提的假設是
因為我之前有次做si-RNA實驗失敗
那次失敗的原因疑似因為transfection reagent沒有mix 好
plate底部分不不均 而transfection reagent在某些地方濃度過高
毒死細胞造成細胞stress
再那一次的實驗中 我的18s ct value有從5~8的range
所以我的這次假設是 也許我的細胞在seed以後只放了24小時就抽RNA
也許導致細胞某種程度也是處於STRESS 所以expression pattern大亂
放48小時(我那次做成功是放48小時)在抽會有比較正常的expression pattern
但是我今天和別的實驗室的學長聊這一點的時候
他的看法是
我的細胞一定是處於某種stress
但是因該不是單存24小時seeding的問題 因為他也有養一樣的細胞株
然後他也是seed 24小時以後就抽
也從來沒有發生過什麼事情
所以他認為最快的方法是換cell line
而我聽他這樣講仔細想想也想到另一種可能的stress
因為我們實驗室一值是用trizol來抽(那個學長的實驗室也是)
但是大概9~10月開始我們改用qiagen的RNA easy kit來抽
RNA easy的lysis buffer不像trizol那麼強
所以我都是先trysinized, 然後離心一次產生pellet
然後再用PBS離心, 洗去medium, 然後加lysis buffer
我在想說有沒有可能我這樣子做會產生stress 導致其expression pattern改變呢?
請問各位的看法又為何?
有人遇到過類似的狀況嗎?
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